Description: Das Projekt "Gerichtete Evolution einer Phenylalanin-Ammoniaklyase zur effizienten enzymatischen Synthese chiraler Amine" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie und Enzymkatalyse durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Chirale Amine und Aminoalkohole haben eine große Bedeutung in der organisch-chemischen und pharmazeutischen Industrie. Sie finden Verwendung für die Produktion enantiomerenreiner Carbonsäuren durch fraktionierte Kristallisation und als chirale Auxiliare und Liganden in enantioselektiven chemischen Synthesen. Besonders hervorzuheben ist der Bedarf an enantiomerenreinen Aminen als Intermediate für die pharmazeutische Industrie und Agrochemie. Neben der selektiven Kristallisation der Enantiomere (max. 50 % Ausbeute) und chemischen Verfahren, stellt bislang die Lipase-katalysierte Racematspaltung das wichtigste enzymatische Verfahren dar. Allerdings werden hier ebenfalls maximal 50 % Ausbeute erreicht und bei Aminoalkoholen ist zusätzlich die Einführung bzw. Entfernung von Schutzgruppen notwendig. Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen (PAL) katalysieren die reversible Addition von Ammoniak an Zimtsäure unter Bildung von optisch reinem L-Phenylalanin. Besonders gut untersucht und rekombinant in E. coli exprimierbar ist das Isoenzym PAL1 aus der Petersilie Petroselinum crispum. Das Ziel des Projekts ist die Veränderung der Substratspezifität und Aktivität der PAL, um diese zur Synthese von chiralen Aminen bzw. Aminoalkoholen, ausgehend von ungesättigten Substraten, darzustellen. Dieses soll sowohl durch rationales Proteindesign als auch durch gerichtete Evolution der PAL erreicht werden. Ziel ist die Erzeugung von PAL-Varianten mit hoher Enantioselektivität, Aktivität und der Fähigkeit auch Substrate ohne Carboxylgruppe umzusetzen, um einen effizienten und umweltfreundlichen Zugang zu chiralen Aminen und Aminoalkoholen zu ermöglichen. Fazit: Im Projektverlauf konnten die für gerichtete Evolution notwendigen Methoden einschließlich des Hochdurchsatzscreenings erfolgreich etabliert werden. In ersten Mutantenbibliotheken konnte keine Aktivität gegenüber Phenylalaninol generiert werden. Computermodeling erwies sich als hilfreiche Methode zur Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum des Enzyms. Aufgrund dessen wurde die Verwendung von Tyrosinol als besser geeignetes Substrat in Kombination mit der pcPAL-Mutante Phe137His vorgeschlagen und tatsächlich geringe Aktivität gemessen. Da ähnliche oder höhere Aktivitäten in echten Tyrosin-Ammoniak-Lyasen zu erwarten waren, wurde die rsTAL aus Rhodobacter sphaeroides als synthetisches Gen mit optimierter Codon-usage bestellt. Die rsTAL zeigte ähnliche Aktivitäten gegenüber Tyrosinol wie die pcPAL. Es wurden verschiedene Mutantenbibliotheken sowie rationale Punktmutationen der pcPAL-Phe137His-Mutante und der rsTAL generiert und nach erhöhter Aktivität durchmustert. Es konnte keine Mutante mit erhöhter Aktivität gegenüber Tyrosinol identifiziert werden. Daher wurde nach alternativen Substraten gesucht. Sowohl Tyrosinamide als auch Tyrosinhydrazid können von pcPAL-Phe137His und rsTAL umgesetzt werden. (Text gekürzt)
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Origin: /Bund/UBA/UFORDAT
Tags: Greifswald ? Amin ? Ammoniak ? Pharmazeutische Industrie ? Aminoalkohol ? Agrarchemie ? Carbonsäure ? Chemische Industrie ? Enzym ? Biotechnologie ? Chemisches Verfahren ? Evolution ? Kristallisation ? Synthese ?
Region: Mecklenburg-Vorpommern
License: cc-by-nc-nd/4.0
Language: Deutsch
Time ranges: 2007-09-01 - 2009-08-31
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