ERA-NET EUPHRESCO: Entwicklung und Validierung von innovativen Diagnosemethoden zum Nachweis von Feuerbrand (Erwinia amylovora)

Description: Feuerbrand wird durch ein Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceen, Erwinia amylovora, verursacht. Dieser in der EU/Richtlinie 2000/129 EG Anhang II gelistete Quarantäneschadorganismus führt an vielen Obst- und Zierpflanzen aus der Familie der Rosaceen zu Absterbeerscheinungen. Eine langfristige Bekämpfung dieser Pflanzenkrankheit erfordert eine Eradikation potentieller Infektionsquellen. Ein Ziel dieses EUPHRESCO-Pilotprojektes war die Entwicklung und Validierung von Methoden, die es ermöglichen, Stämme von E. amylovora zu differenzieren, um damit mögliche Inokulum-Quellen zu identifizieren (source-tracking). Zur Erreichung dieses Ziels wurden verschiedene Ansätze verfolgt: Die Sequenzierung des Genoms von E. amylovora und die Analyse der Plasmid-Diversität bzw. die Verteilung der verschiedenen Plasmide in E. amylovora - Stämme aus unterschiedlichen geographischen Regionen. In diesem Projekt wurden 14 verschiedene E. amylovora - Stämme sequenziert und anhand der Sequenzdaten molekulare Marker identifiziert und hinsichtlich ihrer Eignung für die genetische Typisierung von Stämmen validiert. Spezielle Sequenzen (VNTRs - Variable Number of Tandem Repeat) und die Plasmid-Typisierung waren für source-tracking geeignet. Mit Hilfe des VNTR-Systems wurden High-throughput PCR-Methoden entwickelt und validiert. Eine duplex-PCR wurde zur Typisierung der Plasmide pEA29 und pE170 entwickelt und validiert. Damit stehen zwei neue methodische Ansätze für ein source-tracking von E. amylovora zur Verfügung. Spezielle Probeziehungsplänen für source-tracking konnte aufgrund des engen Zeitrahmens des Projektes nicht erstellt werden. Die Verteilung der verschiedenen Plasmide in europäischen und außereuropäischen E. amylovora - Stämmen wurden mit einer duplex PCR untersucht. Es wurden 1534 verschiedene Stämme gescreent, dabei zeigte sich, dass die Prävalenz des Plasmides pE170 zwischen 0 und 92,8Prozent lag. Ein Screening von spanischen Stämmen ergab, dass das Plasmid pEA29 am häufigsten vorhanden ist. Das gemeinsame Auftreten von pE170 und pE29 ist selten (12Prozent), Stämme ohne die beiden Plasmide kommen fast gar nicht vor (0,7Prozent). Ein weiteres Ziel dieses Projektes war die Validierung von neu entwickelten und publizierten Feuerbrand-Nachweismethoden im Labor und im Freiland. Die Validierung erfolgte in zwei Stufen: Zur Auswahl geeigneter Methoden wurden Voruntersuchungen von verschiedenen Projektpartnern durchgeführt. Danach wurden ausgewählte Methoden in einem Ringtest validiert. Voruntersuchungen umfassten die Auswahl von DNA-Extraktionsmethoden, konventionellen PCR-Assays und real time PCR-Assays. 8 verschiedene DNA-Extraktionsmethoden wurden mit 11 unterschiedlichen Pflanzenmatrices getestet. Je vier Protokolle von DNA-Extraktionsmethoden und neuen konventionellen PCR-Assays wurden für eine Validierung im Ringtest ausgewählt. usw.

SupportProgram

Origins: /Bund/UBA/UFORDAT

Tags: Genom ? Getreide ? Obstbau ? Zierpflanze ? Spanien ? Genetik ? Ringversuch ? Tracer ? DNA ? Mehltau ? Probenaufbereitung ? Bakterien ? EU-Richtlinie ? Geographie ? Pflanzenkrankheit ? Schadorganismus ? Europa ? Anreicherung ? Krankheit ? Krankheitserreger ? Probenahme ? Schädlingsbekämpfung ? Diversität ? Apfel ? Birne ? Feuerbrand ? Nachweisgrenze ? PCR-Technik ? Pflanze, Schädling ? Plasmid ? Sequenzierung ? Validierung ?

License: cc-by-nc-nd/4.0

Language: Deutsch

Organisations

• Bundesministerium für Land- und Forstwirtschaft, Umwelt und Wasserwirtschaft Österreich (Finanzielle Förderung)
• Umweltbundesamt (Bereitstellung)
• Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH (AGES) (Projektverantwortung)

Time ranges: 2008-12-26 - 2010-04-08

Alternatives

• Language: Englisch/English
  Title: ERA-NET EUPHRESCO: Development and validation of innovative diagnostic tools for the detection of fire blight (Erwinia amylovora)
  Description: Fire blight is a devastating disease of apples and pears and related ornamental and crop plants. Erwinia amylovora, causal agent of fire blight, is a quarantine bacterium in Europe and the long-term control of fire blight requires eradication of inoculum reservoirs.One aim of the project was to develop and validate methods for strain level genotyping and pathogen source tracking. The purpose of this aim is to discriminate Erwinia amylovora strains from different geographical regions in order to identify inoculum sources. Three different approaches were used to achieve this aim: Sequencing of the genome of several E. amylovora strains, development of VNTR protocols and analysis of the plasmid content and distribution in E. amylovora strains. 14 different E. amylovora strains were sequenced in the project which is far beyond the expected goal. Based on the analysis of genome sequence data several genomic markers were identified and evaluated for potential application in strain genotyping, including genomic rearrangements, VNTRs (Variable Number Tandem Repeat) and plasmid content. VNTRs and the plasmid content were determined to have the highest potential for application in pathogen source tracking. High-throughput PCR methods based on VNTR-system and plasmid typing methods were developed and validated for source tracking. The development of sampling procedures to effectively determine inoculum sources at local level could not be formalised within the tight time schedule of the work plan. A survey was conducted to estimate the distribution of plasmids in European strains using duplex PCR. Significant deviations were identified in 1.534 screened E. amylovora strains. Prevalence of the plasmid pE170 ranged from 0Prozent up to 92.8Prozent. A screening of Spanish strains revealed that the plasmid pEA29 is most often present (85Prozent). The presence of both plasmids (pEA29 and pE170) is detected in 12Prozent of tested strains. The total absence of both plasmids is very rare (0.7Prozent). Another aim of this project was to validate recently published diagnostic screen tests and recently revised diagnostic protocols by ring testing. Newly available methods such as new PCR assay and real time PCR are reviewed with respect to their specificity, sensitivity and performance. A further topic was the validation of simple techniques that can be confidently performed without specific training on-site (quick tests). In preliminary studies eight different DNA extraction methods were compared on 11 different host materials. Three protocols were selected for further ring testing. It could be shown that the matrix has an influence on the reliability of an extraction method and that the limit of detection is improved after enrichment during the sample preparation. Four novel PCR assays were also shown to be suitable for detection of low level of E. amylovora and were assessed for further ring testing. usw. https://ufordat.uba.de/UFORDAT/pages/PublicRedirect.aspx?TYP=PR&DSNR=1045000

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Aktiv

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