Soil and root samples were taken at the Jena Experiment, a large grassland biodiversity experiment located in the Saale valley near Jena (east Thuringia, Germany, 50°55'N, 11°35'E, 130 m above sea level). In 2002, the experiment was established with a total number of 81 grassland plots of 20 × 20 m (Roscher et al., 2004). The soil type is Eutric Fluvisol and the soil texture changes from sandy loam to silty clay with increasing distance to the Saale river (FAO-Unesco, 1997; Fischer et al., 2014). In June 2016, three surface soil samples (0-10 cm) from each plot were collected, combined to reduce the spatial heterogeneity, and homogenized. The soil samples were sieved (2 mm mesh size). Fine roots (if present) were picked using steel tweezers and stored at −20 ℃. The root samples were taken separately from six plots with different combinations of four functional groups (grass, legume, tall herb, small herb; Table S1). The roots were washed, freeze-dried and frozen. All fungal strains used originate from Jena Microbial Resource Collection (JRMC), University of Jena and HKI, Germany. The saprotrophic fungi Schizophyllum commune FSU:3214xFSU:2896 and Mucor plumbeus JMRC:SF:013709 were cultivated in Petri dishes on solid complex yeast medium (CYM; Schwalb and Miles, 1967) and the mycorrhizal fungi Tricholoma vaccinum JMRC:FSU:4731 and Pisolithus tinctorius FSU:10019 on modified Melin Norkrans b (MMNb) medium (Kottke et al., 1987) at room temperature for 2 and 5 days for the fast growing M. plumbeus and S. commune and 2 and 3 weeks for the slow growing P. tinctorius and T. vaccinum (Table S1). Further six bacterial strains were chosen for this study: Streptomyces acidiscabies E13 (JMRC:ST:033552 from JRMC), Streptomyces mirabilis P16B-1 (Schmidt et al., 2009), Bacillus subtilis DSM-10, Agrobacterium tumefaciens DSM-30150, Pseudomonas fluorescens DSM-50090 (DSMZ, Braunschweig, Germany), and Acetobacter xylinum NQ5 (ATCC 53582; ATCC, USA European Office at Wesel, Germany). The strains were cultivated for 2 to 5 days in Petri dishes on minimal medium (MM; Schmidt et al. 2009) at 28 °C. The collembolans species Heteromurus nitidus (Templeton, 1835) and Folsomia candida Willem, 1902 were taken from laboratory cultures fed with baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae; Table S1). Laboratory cultures were maintained in glass jars filled with moist potting soil at 15 °C in darkness and kept moist with distilled water. Before analysis, collembolans were starved for three days to empty their guts; subsequently they were frozen and stored in methanol. Polysphondylium pallidum strain was from the Stallforth Lab at Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology in Jena (Germany). Amoebae were cultured (xenically) in the presence of the bacterium Klebsiella aerogenes as food. Briefly, amoebal spore suspension (from previously collected sori) was added to the surface of SM/5 agar plate seeded with 1 X 108 CFU/ml food bacterium K. aerogenes. Plates were incubated at 22°C for 7 to 10 days for mature fruiting bodies to appear. The entire cell mass of amoebal fruiting bodies was carefully collected using a sterile inoculation loop and suspended in KK2 buffer. This cell mass was washed clean of any attached bacteria using the same buffer. Resulting amoebal cells were then subjected to further analysis. Before analyses, roots, fungi, collembolans and amoebae were frozen in liquid nitrogen. They were ground into fine powder and extracted using the same protocol as for the soil samples. Cultured bacteria were collected from Petri dish plates, weighed and extracted using the same protocol.
Die Transformation von 'Arabidopsis thaliana' über die so genannte 'floral dip'-Methode vereinfacht die Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen. Es ist keine Gewebekultur bzw. keine Regenation der transgenen Pflanzen mehr notwendig. Dies bedeutet auch den Wegfall der Selektion gegen die 'Agrobacterium'-Stämme mit entsprechenden Antibiotika nach der Transformation. Ziel des Projekts ist es, zu prüfen, inwieweit die neue Transformationsmethode eine Persisitenz der verwendeten Agrobakterien und ggf. einen Gentransfer in die autochthone Bakterienflora der Pflanzen ermöglicht.
Cassava is a crop used by subsistence farmers in tropical and subtropical regions. It is extensively cultivated in certain regions of India and also in other Asian and African countries, and its cultivation is expected to further increase due to climate changes and increased water shortage, since cassava is drought-adaptive. Viruses, especially the begomoviruses Indian cassava mosaic-, Sri Lankan cassava mosaic- and African Cassava mosaic viruses (ICMV,SLCNV,ACMV here commonly I/SL/ACMV) cause dramatic losses in cassava cultivation. The plant recognizes viral RNA in the form of double-strand (ds)RNA, a by-product of virus replication. Long dsRNA is chopped by dicer enzymes into small interfering (si)RNAs, 21 to 24 base pair duplexes, consisting of a guide and a passenger-strand. The guide-strand forms together with the Slicer protein AGO a 'RISC'-complex which recognizes and cleaves cognate, i.e. in our case viral RNA. A remarkable feature of RNA interference (RNAi) is that, once started, it initiates a positive feedback loop, whereby the sliced RNA fragments are converted to more dsRNA by host RNA-dependent RNA polymerase, which give rise to more siRNAs. Furthermore, siRNAs or other components of the silencing pathway invade the plant systemically and protect from virus proliferation. Our antiviral strategy is to shift this equilibrium in favour of the plant by providing dsRNA cognate to the virus sequences. As a result, more siRNAs are produced, more virus RNA is destroyed and more systemic silencing signal reaches the growing tissue. Finally plants recover fast from initial infection or even become immune to incoming virus. Our project involves isolation, sequencing and cloning of the I/SL/ACV virus populations and their satellites occurring in the states of Andhra Pradesh, Maharashtra, Kerala, and Tamil Nadu. From these sequences a series of constructs will be derived that express hairpins, i.e. dsRNA with a loop between the RNA arms. We will construct variants that target all these viruses, including those that mimic natural micro (mi)RNAs or transacting (ta)siRNAs down-regulating host genes, and those provided with constitutive or virus-inducible promoters. We will optimize these constructs in transient assays to select those most efficient in initiating siRNA production. Selected constructs will then be cloned in Agrobacterium Ti-plasmid vectors and used for transformation of host plants. Although virus-resistant cassava is our goal, preliminary tests of the constructs could also be performed with the easily transformable Nicotiana benthamiana in one of our labs, as has been done by the applicants for African cassava mosaic begomovirus or with a more easily transformable model cassava cultivar with the help of Dr. Peng Zhang, Chinese academy of Science, Shanghai, thus extending a former collaboration of the Basel group with him.
Es soll untersucht werden, ob bei der Erzeugung gentechnisch veränderter Pappeln durch Transformation mit Agrobacterium tumefaciens ein Risiko des horizontalen Gentransfers transgener DNA auf die in den Pflanzen enthaltenen (endophytischen) Bakterien besteht. Daneben soll geprüft werden, ob und wie lange die verwendeten Agrobakterien in den transgenen Pappeln persistieren können. Die in vielen Gehölzen nachgewiesenen endophytischen Bakterien sollen isoliert, morphologisch/physiologisch charakterisiert und mit genetischen Methoden identifiziert werden. Für einzelne Gruppen endophytischer Bakterien wird eine mögliche Übertragung der transgenen DNA von den Agrobakterien über den Prozess der Konjugation in vitro überprüft. Ebenfalls wird die Möglichkeit dieses horizontalen Gentransfers nach der Transformation von Pappeln untersucht. Die Analyse der gentechnisch veränderten Pappeln erfolgt zu unterschiedlichen Zeiten nach der Transformation und in transgenen Pappeln, die bereits vor Jahren transformiert wurden. Im Ergebnis des Projekts soll die Wahrscheinlichkeit eines Gentransfers von transgener DNA auf die endophytische Mikroflora am Modellorganismus Pappel abgeschätzt werden.
Im Projekt soll die ökologische Relevanz eines horizontalen Gentransfers innerhalb der endophytischen Mikroflora von Forstgehölzen untersucht und bewertet werden. Hierzu wird in einem Modellsystem mit Pappel-Stecklingen/Jungpflanzen ein Gentransfer über die bakterielle Konjugation in die Endophytenmikroflora induziert. Der Gentransfer erfolgt durch ein rekombinantes Plasmid mit einem geeigneten Reportergen, das in vitro in einen Agrobakterien- und einen endophytischen Bakterienstamm eingebracht wurde. Es wird geprüft, inwieweit sich das rekombinante Plasmid in der Endophytenmikroflora etablieren kann. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Abschätzung des Entlassens des rekombinanten Plasmids aus der Endophytenmikroflora der Pappel in verschiedene Umweltmedien (Boden und zersetztes Pflanzenmaterial).
In einem Verbundprojekt der Justus-Liebig-Universität Gießen, des IPK Gatersleben und der Maltagen GmbH, Andernach, werden transgene Gerstenlinien mit erhöhter Pilzresistenz oder verbesserte Futtereigenschaft bezüglich sicherheitsrelevanter Eigenschaften untersucht. Folgende Transgene stehen zur Verfügung: (a) Das thermostabile (1,3-1,4)-beta-Glucanase Gen aus Bacillus amyloliquefaciens liegt bereits in modernen Hochleistungssorten vor und wird seit 1996 unter Feldbedingungen an der Washington State University, Pullman, WA USA evaluiert. (b) Transgene Pflanzen, die das Trichoderma harzianum ThEn42 Gen für Endochitinase Aktivität ausdrücken, zeigen Resistenz gegenüber einem Wurzelkrankheitskomplex verursacht durch Rhizoctonia solani und Rhizoctonia oryzae mit soweit heute bekannt hoher Gattungsspezifität. Der künftige Markt für diese und weitere erst zu erstellende optimierte Transformanten der transgenen Eigenschaft 'Pilzresistenz' ist deshalb so groß, weil insbesondere die Kontrolle von Wurzel- und Ährenpathogenen unter heutigen Produktionsbedingungen aufgrund fehlender oder unzureichender chemischer Wirkstoffe und nicht existierenden resistenten 'germplasms' problematisch ist. Ganz gezielt könnte damit ein Einsatz der hier unter Sicherheitsaspekten bearbeiteten transgenen Pflanzen zu einer substanziellen Lösung von schwerwiegenden Problemen des weltweiten Pflanzenschutzes auf Basis biotechnologischer Strategien beitragen. In dem vorgeschlagenen Projekt sollen die transgenen Pflanzen im Gewächshaus und im Feldanbau unter folgenden Aspekte untersucht werden: (a) Eine detaillierte Studie der direkten Interaktion von (transgener) Pflanze mit pilzlichem Mikroorganismus sowie eine Studie zur Epidemiologie der Pilzentwicklung auf transgener Gerste unter Feldbedingungen (inkl. nützlichen Endophyten und Mykotoxinbildnern). (b) Evaluation der Effekte des Transgens auf die substanzielle Äquivalenz sowie auf Inhaltsstoffe und Kornqualität unter den Bedingungen des Feldanbaus (Pathogendruck und Mykorrhizierung). (c) Verbesserung der Transformationseffizienz und Sicherheit durch gezielte Einzelintegration des Transgens bei Agrobakterium vermittelter Transformation unter Verwendung von synthetischen T-DNAs. Die Feldstudien sollen unter den Produktionsbedingungen des 'low inputs' (reduzierte Bodenbearbeitung, reduzierte Pflanzenschutzmaßnahmen, reduzierte Saatdichte, reduzierte Düngung) im Vergleich zu intensiver Bewirtschaftung vergleichend angelegt werden. Einen Kern des Projektes bildet die Frage nach dem Verhalten von, transgener pilzresistenter Gerste auf die Besiedlung durch schädliche Pathogene und nützliche Endophyten. usw.
Ziel des Projektes ist die Erstellung einer Literaturübersicht zum Stand der Entwicklung transgener Gehölze und zu den Möglichkeiten (Risikopotential) eines horizontalen Gentransfers in Forstgehölzen. Bei der Erzeugung transgener Gehölze werden binäre Vektoren verwendet, die aus den natürlichen Ti-Plasmiden von Agrobakterien entwickelt wurden. Mit Hilfe dieser Vektorsysteme wird die zu übertragende rekombinante DNA in die Pflanzenzellen eingeschleust. Daneben kann die DNA über bakteriellen Gentransfer auch in andere Bakterien übertragen werden. Durch das Vorhandensein endophytischer Bakterien in Bäumen und die relativ lange Persistenz der Agrobakterien in transformierten Gehölzen besteht somit ein Risiko des horizontalen Gentransfers, das bisher kaum beschrieben wurde. In der Studie wird der Kenntnisstand zum Vorkommen von Endophyten in Forstgehölzen, zur Persistenz von Agrobakterien sowie zu den Mechanismen des bakteriellen Gentransfers dokumentiert. In Verbindung mit den Eigenschaften der verwendeten Vektoren werden hieraus prinzipielle Möglichkeiten für den Gentransfer in die Endophytenflora beschrieben und Schlussfolgerungen für den Forschungsbedarf abgeleitet.
General Information: The objective of the project is the cleavage of the CMV RNA genome by ribozymes, for which the genetic information will be engineered into the plant genome via the Agrobacterium technique. Transgenic plants will be tested by inoculation with purified virus particles.
Pflanzliche P450-Enzyme besitzen sowohl Aufgaben im Primär- und Sekundärstoffwechsel der Pflanzen als auch in der Metabolisierung von Xenobiotika einschließlich Herbiziden. Da z.B. Mais eine natürliche Resistenz gegenüber dem Triazin-Herbizid Atrazin aufweist, konnten suszeptible Wildpflanzen, die bei Feldanbau neben den Kulturpflanzen aufkommen, durch Anwendung des Herbizids ohne Schädigung der Kulturpflanzen selektiv bekämpft werden (Herbizidselektivität). Kulturpflanzen wie z.B. Tabak und Kartoffel, die keine oder nur eine unzureichende natürliche Resistenz gegenüber einem bestimmten Herbizid besitzen, können durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation mit einem Säuger-P450-Isoenzym (z.B. CYP1A1 oder CYP1A2) Herbizid-resistent werden. Seit einigen Jahren gibt es in dieser Richtung Bestrebungen, P450-transgene Pflanzen herzustellen. Aufgrund der überlappenden, breiten Substratspezifität des jeweils eingebrachten Säuger-P450-Isoenzyms (Ratte, Mensch) wird in den transgenen Pflanzen meist eine multiple Resistenz gegen verschiedene Herbizide mit unterschiedlichen Strukturen und Wirkmechanismen beobachtet. Vor der Vermarktung von transgenen Pflanzen müssen diese in Feldversuchen getestet werden. Dabei wird die Verträglichkeit des Genproduktes, die Eigenschaften der modifizierten Pflanze, die Expressionsstabilität des eingebrachten Fremd-Gens und mögliche ökologische Auswirkungen untersucht. Zusätzlich sollte neben der Substratspezifität des fremden P450-Isoenzyms gegenüber Xenobiotika getestet werden, ob pflanzliche Sekundärmetaboliten als Substrate in Frage kommen. Außerdem sind mögliche Einflüsse auf den normalen Stoffwechsel der Pflanzen von Interesse, die sich auf den Phänotyp der Pflanzen auswirken können. Z.B. wurde bei Cyp2c14-transformierten Tabak-Pflanzen (aus Kaninchen) eine verstärkte Seneszenz beschrieben, die sich in einem verringertem Chlorophyll-Gehalt, einem erhöhten Gehalt an Abbauprodukten der Lipid-Peroxidation und einem Abbauprodukt des Nornicotins und in einer Abnahme des Nicotin-Gehaltes äußerte. Außerdem wuchsen die Pflanzen langsamer und brauchten mehr Zeit zur Bewurzelung. Dies sind Anzeichen dafür, dass das Einbringen eines Fremd-P450-Gens in Tabak über die oxidative Veränderung der Membranlipide oder -sterole und damit über die Veränderung der Membranstruktur, durch einen hormonellen Eingriff durch Umsetzung eines Brassinosteroids oder die Unterdrückung endogener P450-Gene möglicherweise schwerwiegende metabolische Auswirkungen zur Folge haben kann. Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob die Agrobakterien-vermittelte Transformation von Tabak mit der cDNA des humanen CYP1A2 Auswirkungen auf den endogenen Nicotin-Gehalt der Pflanzen zur Folge haben. CYP1A2 gehört dabei neben anderen Isoenzymen im Gegensatz zu den Hauptenzymen CYP2A6, CYP2B6 und CYP2D6 zu den Isoenzymen, die Nicotin nur bei hoher Substratkonzentration umsetzen. Nicotin besitzt dabei als natürliches Insektizid eine wichtige ökol u.s.w.
*Im Rahmen des Projektes wurden alle notwendigen Ausgangsmaterialien für die DNA Mikroinjektion hergestellt. Hierzu wurden für das Reporterenzym GFP sowie das Resistenzgen gegen Verticillium dahliae verschiedene reine Expressionskassetten hergestellt. Die Gene standen dabei unter transkriptioneller Kontrolle des konstitutiven 35S Promotors. Es galt zu prüfen, ob und inwieweit die Transformationseffizienz durch die Verwendung der Restriktionsenzyme (Munl, I-Scel) oder der Integrationsproteine aus Agrobakterium tumefaciens (Agroinjektion) im Vergleich zu nackter DNA gesteigert werden kann. Unter Berücksichtigung der verschiedenen Strategien sollten für diese Gene transgene Pflanzen der ersten (mit selektiven Marker) und zweiten Generation (ohne selektiven Marker) erzeugt werden. In anschließenden DNA-Mikroinjektionsexperimenten konnten transgene Pflanzen der ersten Generation nur unter Verwendung der 'Agroinjektion' erzeugt werden. Für beide Konstrukte konnten mehrere unabhängige Pflanzen etabliert werden, wobei die molekulare Analyse des Genoms eindeutig das Vorliegen von Mehrfachintegrationen gezeigt hat. Der Nachweis der Expression der Gene konnte zudem mittels Northern- und Western Analytik belegt werden. Transgene Pflanzen der zweiten Generation konnten im Projekt nicht identifiziert werden, was sehr wahrscheinlich auf das Fehlen eines selektiven Markers zurückzuführen ist. Bei Nichtverwendung selektiver Medien können transgene Zellen sehr einfach durch Wildtypzellen überwuchert werden, da diese vorab nicht verletzt wurden (Mikroinjektion) und somit zeitlich schneller Kalli ausbilden können. Die erzielten Ergebnisse sind künftig von großem Nutzen für die Weiterentwicklung der DNA-Mikroinjektion als Alternative zu bestehenden Pflanzentransformationssystemen. Mittlerweile konnten wir in Zusammenarbeit mit der Universität Giessen zeigen, dass mit nur geringfügigen Abweichungen in den Parametern die Erzeugung transgener Pflanzen ohne Agroinjektion möglich wird. Nach Verifizierung dieser Modifikationen wäre denkbar, die Mikroinjektion ohne großen Aufwand auch kommerziell zu nutzen, welches im Sinne des Verwertungsplanes ist.
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