Genom-Editierung von regulatorischen Regionen im Pflanzengenom hat das Potenzial schnelle Verbesserungen von Nutzpflanzen zu ermöglichen und damit zur Ernährungssicherheit beizutragen. In diesem Projekt werde ich cis-regulatorische Elemente von Pflanzen und deren Interaktionen—die regulatorische Grammatik—untersuchen und Methoden für die Genom-Editierung von regulatorischer DNA entwickeln. Die Genexpression wird durch cis-regulatorische Elemente wie Promotern, Enhancer, Silencer und Insulatoren kontrolliert. Die Genom-Editierung von solchen Elementen ist eine vielversprechende Strategie, um Eigenschaften von Nutzpflanzen zu verbessern. Mutationen in regulatorischen Regionen führen oft zu Gewebe- oder Umweltbedingungsspezifischen Veränderungen der Genexpression und können daher weniger schädlich sein als Mutationen in genkodierenden Regionen. Evolution und Domestikation haben oft auf regulatorische DNA eingewirkt. Uns fehlt jedoch bisher ein ausreichendes Verständnis von cis-regulatorischen Elementen und der regulatorischen Grammatik, um Genom-Editierung von regulatorischen Elementen routinemäßig zur Verbesserung von Nutzpflanzen einzusetzen. Ich habe „plant STARR-seq“, eine Hochdurchsatz-Methode zur Charakterisierung von cis-regulatorischen Elementen, entwickelt. In diesem Projekt werde ich „plant STARR-seq“ verwenden, um unser Verständnis der Genregulation in Pflanzen zu erweitern: (1) Ich werde Insulatoren und Silencer in Pflanzen charakterisieren, da diese Elemente benötigt werden für eine präzise Kontrolle über die Expression von Transgenen für effiziente Genom-Editierung von Nutzpflanzen; (2) ich werde die Interaktionen innerhalb und zwischen cis-regulatorischen Elementen untersuchen; und (3) ich werde erforschen wie Interaktionen zwischen cis-regulatorischen Elementen und in trans agierenden Proteinen die Genregulation in Pflanzen beeinflussen. Diese Untersuchungen werden zu einem umfassenden Verständnis der Regeln, welche die Aktivität und Stärke von regulatorischer DNA in Pflanzen bestimmen, führen und es uns ermöglichen die pflanzliche Genregulation zu prognostizieren und zu manipulieren. Parallel zur Untersuchung der regulatorischen Grammatik werde ich eine Methode zur Transgen-freien Genom-Editierung von cis-regulatorischen Elementen entwickeln. Aktuelle Techniken zur gezielten Genom-Editierung von Pflanzen müssen sich Skepsis gegenüber transgenen Organismen und Bedenken wegen unbeabsichtigten Mutationen stellen. In diesem Projekt werde ich einen alternativen Ansatz zur Genom-Editierung entwickeln bei dem die DNA-verändernden Proteine in Agrobakterien exprimiert und anschließend in die Pflanzenzellen exportiert werden, ohne dabei gleichzeitig auch DNA zu übertragen. Diese Methode führt zu Transgen-freien Pflanzen und reduziert die Zahl von unbeabsichtigten Mutationen, da die DNA-verändernden Proteine nicht konstitutiv produziert werden.
Das im Boden vorkommende Bakterium Agrobacterium tumefaciens infiziert eine Vielzahl von Pflanzenarten und verursacht die Wurzelhalsgallenkrankheit. Es überträgt bakterielle DNA zusammen mit Effektorproteinen in Wirtszellen. Diese T-DNA (Transfer-DNA) wird stabil in das Pflanzengenom integriert, und die Expression der darin kodierten Onkogene führt zu Zellproliferation und Tumorbildung. Die Fähigkeit, DNA in das Wirtsgenom zu übertragen, hat A. tumefaciens zu einem der wichtigsten Werkzeuge in der pflanzlichen Gentechnik gemacht. Allerdings sind viele Pflanzenarten weiterhin schwierig zu transformieren, und es ist unklar, woran das liegt. Dies ist auch eine Folge unseres unzureichenden Wissens über die molekularen Voraussetzungen auf Seiten der Wirtszellen. In einer Reihe unabhängiger Experimente haben wir beobachtet, dass eine veränderte Sphingolipidzusammensetzung von Arabidopsispflanzen die Agrobakterien-Transformationseffizienz signifikant beeinflusst. Pflanzliche Sphingolipide wie Glucosylceramide und Glucosylinositolphosphorylceramide (GIPCs) sind vorwiegend in Nanodomänen der Plasmamembran lokalisiert. Frühere Studien in Arabidopsis haben gezeigt, dass Sphingolipide die Funktion von membranständigen Rezeptoren und Calciumkanälen beeinflussen können, welche für verschiedene Signaltransduktionsprozesse wichtig sind. Sphingolipide könnten daher in verschiedenen Phasen der Agrobacterium-Transformation eine Funktion haben, z. B. durch Beeinflussung membranständiger Rezeptoren, die Abwehrreaktionen auslösen, oder durch die Interaktion mit bakteriellen Proteinen des Typ-IV-Sekretionssystems während des T-DNA-Transfers durch die Plasmamembran. Dieses Projekt zielt daher darauf ab, diejenigen pflanzlichen Sphingolipid-Spezies zu identifizieren, die die Agrobacterium-Transformationseffizienz beeinflussen, und die Funktion dieser Lipide während der verschiedenen Transformationsstadien zu charakterisieren. Um die Auswirkungen verschiedener Sphingolipidprofile auf die Transformationseffizienz zu ermitteln, setzen wir einen etablierten in vivo Transformationseffizienztest ein. In diesem werden wir unsere Sammlung von Arabidopsis-Mutantenlinien mit veränderter Sphingolipidzusammensetzung, sowie eine Reihe von pharmakologischen und Temperatur-Behandlungen testen. Zur Identifizierung der relevanten Sphingolipide setzen wir Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und anschließende Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) ein. Anschliessend werden wir analysieren, in welcher Phase der Transformation diese Lipide beteiligt sind. Dazu werden wir im in vivo System Wachstum, Anheftung und die Expression von Virulenzgenen der Bakterien testen und parallel dazu die Abwehrreaktion der Pflanze und die subzelluläre Lipidzusammensetzung analysieren. Wir erwarten, dass die Charakterisierung dieser Sphingolipid-abhängigen Prozesse in der Wirtszelle unser Verständnis der Mechanismen der Pflanzentransformation durch Agrobakterien entscheidend verbessern wird.
Soil and root samples were taken at the Jena Experiment, a large grassland biodiversity experiment located in the Saale valley near Jena (east Thuringia, Germany, 50°55'N, 11°35'E, 130 m above sea level). In 2002, the experiment was established with a total number of 81 grassland plots of 20 × 20 m (Roscher et al., 2004). The soil type is Eutric Fluvisol and the soil texture changes from sandy loam to silty clay with increasing distance to the Saale river (FAO-Unesco, 1997; Fischer et al., 2014). In June 2016, three surface soil samples (0-10 cm) from each plot were collected, combined to reduce the spatial heterogeneity, and homogenized. The soil samples were sieved (2 mm mesh size). Fine roots (if present) were picked using steel tweezers and stored at −20 ℃. The root samples were taken separately from six plots with different combinations of four functional groups (grass, legume, tall herb, small herb; Table S1). The roots were washed, freeze-dried and frozen. All fungal strains used originate from Jena Microbial Resource Collection (JRMC), University of Jena and HKI, Germany. The saprotrophic fungi Schizophyllum commune FSU:3214xFSU:2896 and Mucor plumbeus JMRC:SF:013709 were cultivated in Petri dishes on solid complex yeast medium (CYM; Schwalb and Miles, 1967) and the mycorrhizal fungi Tricholoma vaccinum JMRC:FSU:4731 and Pisolithus tinctorius FSU:10019 on modified Melin Norkrans b (MMNb) medium (Kottke et al., 1987) at room temperature for 2 and 5 days for the fast growing M. plumbeus and S. commune and 2 and 3 weeks for the slow growing P. tinctorius and T. vaccinum (Table S1). Further six bacterial strains were chosen for this study: Streptomyces acidiscabies E13 (JMRC:ST:033552 from JRMC), Streptomyces mirabilis P16B-1 (Schmidt et al., 2009), Bacillus subtilis DSM-10, Agrobacterium tumefaciens DSM-30150, Pseudomonas fluorescens DSM-50090 (DSMZ, Braunschweig, Germany), and Acetobacter xylinum NQ5 (ATCC 53582; ATCC, USA European Office at Wesel, Germany). The strains were cultivated for 2 to 5 days in Petri dishes on minimal medium (MM; Schmidt et al. 2009) at 28 °C. The collembolans species Heteromurus nitidus (Templeton, 1835) and Folsomia candida Willem, 1902 were taken from laboratory cultures fed with baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae; Table S1). Laboratory cultures were maintained in glass jars filled with moist potting soil at 15 °C in darkness and kept moist with distilled water. Before analysis, collembolans were starved for three days to empty their guts; subsequently they were frozen and stored in methanol. Polysphondylium pallidum strain was from the Stallforth Lab at Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology in Jena (Germany). Amoebae were cultured (xenically) in the presence of the bacterium Klebsiella aerogenes as food. Briefly, amoebal spore suspension (from previously collected sori) was added to the surface of SM/5 agar plate seeded with 1 X 108 CFU/ml food bacterium K. aerogenes. Plates were incubated at 22°C for 7 to 10 days for mature fruiting bodies to appear. The entire cell mass of amoebal fruiting bodies was carefully collected using a sterile inoculation loop and suspended in KK2 buffer. This cell mass was washed clean of any attached bacteria using the same buffer. Resulting amoebal cells were then subjected to further analysis. Before analyses, roots, fungi, collembolans and amoebae were frozen in liquid nitrogen. They were ground into fine powder and extracted using the same protocol as for the soil samples. Cultured bacteria were collected from Petri dish plates, weighed and extracted using the same protocol.
General Information: The objective of the project is the cleavage of the CMV RNA genome by ribozymes, for which the genetic information will be engineered into the plant genome via the Agrobacterium technique. Transgenic plants will be tested by inoculation with purified virus particles.
Es soll untersucht werden, ob bei der Erzeugung gentechnisch veränderter Pappeln durch Transformation mit Agrobacterium tumefaciens ein Risiko des horizontalen Gentransfers transgener DNA auf die in den Pflanzen enthaltenen (endophytischen) Bakterien besteht. Daneben soll geprüft werden, ob und wie lange die verwendeten Agrobakterien in den transgenen Pappeln persistieren können. Die in vielen Gehölzen nachgewiesenen endophytischen Bakterien sollen isoliert, morphologisch/physiologisch charakterisiert und mit genetischen Methoden identifiziert werden. Für einzelne Gruppen endophytischer Bakterien wird eine mögliche Übertragung der transgenen DNA von den Agrobakterien über den Prozess der Konjugation in vitro überprüft. Ebenfalls wird die Möglichkeit dieses horizontalen Gentransfers nach der Transformation von Pappeln untersucht. Die Analyse der gentechnisch veränderten Pappeln erfolgt zu unterschiedlichen Zeiten nach der Transformation und in transgenen Pappeln, die bereits vor Jahren transformiert wurden. Im Ergebnis des Projekts soll die Wahrscheinlichkeit eines Gentransfers von transgener DNA auf die endophytische Mikroflora am Modellorganismus Pappel abgeschätzt werden.
Ziel des Projektes ist die Erstellung einer Literaturübersicht zum Stand der Entwicklung transgener Gehölze und zu den Möglichkeiten (Risikopotential) eines horizontalen Gentransfers in Forstgehölzen. Bei der Erzeugung transgener Gehölze werden binäre Vektoren verwendet, die aus den natürlichen Ti-Plasmiden von Agrobakterien entwickelt wurden. Mit Hilfe dieser Vektorsysteme wird die zu übertragende rekombinante DNA in die Pflanzenzellen eingeschleust. Daneben kann die DNA über bakteriellen Gentransfer auch in andere Bakterien übertragen werden. Durch das Vorhandensein endophytischer Bakterien in Bäumen und die relativ lange Persistenz der Agrobakterien in transformierten Gehölzen besteht somit ein Risiko des horizontalen Gentransfers, das bisher kaum beschrieben wurde. In der Studie wird der Kenntnisstand zum Vorkommen von Endophyten in Forstgehölzen, zur Persistenz von Agrobakterien sowie zu den Mechanismen des bakteriellen Gentransfers dokumentiert. In Verbindung mit den Eigenschaften der verwendeten Vektoren werden hieraus prinzipielle Möglichkeiten für den Gentransfer in die Endophytenflora beschrieben und Schlussfolgerungen für den Forschungsbedarf abgeleitet.
Die Transformation von 'Arabidopsis thaliana' über die so genannte 'floral dip'-Methode vereinfacht die Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen. Es ist keine Gewebekultur bzw. keine Regenation der transgenen Pflanzen mehr notwendig. Dies bedeutet auch den Wegfall der Selektion gegen die 'Agrobacterium'-Stämme mit entsprechenden Antibiotika nach der Transformation. Ziel des Projekts ist es, zu prüfen, inwieweit die neue Transformationsmethode eine Persisitenz der verwendeten Agrobakterien und ggf. einen Gentransfer in die autochthone Bakterienflora der Pflanzen ermöglicht.
Cassava is a crop used by subsistence farmers in tropical and subtropical regions. It is extensively cultivated in certain regions of India and also in other Asian and African countries, and its cultivation is expected to further increase due to climate changes and increased water shortage, since cassava is drought-adaptive. Viruses, especially the begomoviruses Indian cassava mosaic-, Sri Lankan cassava mosaic- and African Cassava mosaic viruses (ICMV,SLCNV,ACMV here commonly I/SL/ACMV) cause dramatic losses in cassava cultivation. The plant recognizes viral RNA in the form of double-strand (ds)RNA, a by-product of virus replication. Long dsRNA is chopped by dicer enzymes into small interfering (si)RNAs, 21 to 24 base pair duplexes, consisting of a guide and a passenger-strand. The guide-strand forms together with the Slicer protein AGO a 'RISC'-complex which recognizes and cleaves cognate, i.e. in our case viral RNA. A remarkable feature of RNA interference (RNAi) is that, once started, it initiates a positive feedback loop, whereby the sliced RNA fragments are converted to more dsRNA by host RNA-dependent RNA polymerase, which give rise to more siRNAs. Furthermore, siRNAs or other components of the silencing pathway invade the plant systemically and protect from virus proliferation. Our antiviral strategy is to shift this equilibrium in favour of the plant by providing dsRNA cognate to the virus sequences. As a result, more siRNAs are produced, more virus RNA is destroyed and more systemic silencing signal reaches the growing tissue. Finally plants recover fast from initial infection or even become immune to incoming virus. Our project involves isolation, sequencing and cloning of the I/SL/ACV virus populations and their satellites occurring in the states of Andhra Pradesh, Maharashtra, Kerala, and Tamil Nadu. From these sequences a series of constructs will be derived that express hairpins, i.e. dsRNA with a loop between the RNA arms. We will construct variants that target all these viruses, including those that mimic natural micro (mi)RNAs or transacting (ta)siRNAs down-regulating host genes, and those provided with constitutive or virus-inducible promoters. We will optimize these constructs in transient assays to select those most efficient in initiating siRNA production. Selected constructs will then be cloned in Agrobacterium Ti-plasmid vectors and used for transformation of host plants. Although virus-resistant cassava is our goal, preliminary tests of the constructs could also be performed with the easily transformable Nicotiana benthamiana in one of our labs, as has been done by the applicants for African cassava mosaic begomovirus or with a more easily transformable model cassava cultivar with the help of Dr. Peng Zhang, Chinese academy of Science, Shanghai, thus extending a former collaboration of the Basel group with him.
Im Projekt soll die ökologische Relevanz eines horizontalen Gentransfers innerhalb der endophytischen Mikroflora von Forstgehölzen untersucht und bewertet werden. Hierzu wird in einem Modellsystem mit Pappel-Stecklingen/Jungpflanzen ein Gentransfer über die bakterielle Konjugation in die Endophytenmikroflora induziert. Der Gentransfer erfolgt durch ein rekombinantes Plasmid mit einem geeigneten Reportergen, das in vitro in einen Agrobakterien- und einen endophytischen Bakterienstamm eingebracht wurde. Es wird geprüft, inwieweit sich das rekombinante Plasmid in der Endophytenmikroflora etablieren kann. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Abschätzung des Entlassens des rekombinanten Plasmids aus der Endophytenmikroflora der Pappel in verschiedene Umweltmedien (Boden und zersetztes Pflanzenmaterial).
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