Development of insecticide resistance in insect pest species is one of the main threats of agriculture nowadays. The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is the noctuid species possessing by far the most reported cases of insecticide resistance worldwide, correlated with one of the widest geographical distributions of any agricultural pest species. This turns H. armigera into an adequate model to study resistance mechanisms in detail. The main mechanisms underlying insecticide resistance are target side insensitivity and metabolism, mainly due to carboxylesterases and cytochrome P450 monooxygenases. Just recently, the resistance mechanism of an Australian H. armigera strain toward the pyrethroid fenvalerate was ascribed to a single P450, CYP337B3. CYP337B3 is a naturally-occurring chimera between CYP337B2 and CYP337B1 evolved by an unequal crossing-over event. This enzyme had acquired new and exclusive substrate specificities resulting in the detoxification of fenvalerate. This is the first known case of recombination as an additional genetic mechanism, besides over-expression and point mutation, leading to insecticide resistance. Therefore, CYP337B1, CYP337B2, and CYP337B3 are ideal candidates for studying structure-function relationships in P450s. The project aims to characterize amino acids that are crucial for the activity of CYP337B3 toward detoxification of fenvalerate. Additionally, cross-resistance conferred by CYP337B3 enables the determination of common structural moieties of pyrethroids favoring detoxification by CYP337B3 and those leading to resistance breaking. Pyrethroids with identified resistance breaking moieties could be used to control even pyrethroid-resistant populations of H. armigera. Another advantage of this system is the conferment of insecticide resistance by CYP337B3 that is not restricted to Australia but seems to be a more common mechanism as recently revealed by the finding of the chimeric P450 in a cypermethrin-resistant Pakistani strain. To shed light on the contribution of CYP337B3 to pyrethroid resistance of H. armigera and even closely related species worldwide, field populations from different countries will be screened by PCR for the presence of CYP337B3 and its parental genes. If applicable, the allele frequency of CYP337B3 will be determined being a convenient method to conclude the resistance level of the tested populations. Finally, the project will result in advising farmers on the control of populations of H. armigera and related species possessing CYP337B3. This will even become more important due to the climate change allowing H. armigera to spread northward including central Europe, where H. armigera is not yet able to survive wintertime.
Die Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen wurde am Beispiel von Transienten zwischen oxischem und denitrifizierendem Wachstum von Paracoccus denitrificans studiert. Bei solchen Wechseln muss die membrangebundene Elektronentransportkette jeweils den neuen Bedingungen angepasst werden. Diese Vorgaenge wurden anhand der Aenderungen in der Zusammensetzung der Cytochrome analysiert. Im weiteren wurde auch den Endprodukten der Denitrifikation besondere Beachtung geschenkt. Es zeigte sich, dass das Verhaeltnis zwischen molekularem Stickstoff und Lachgas bei der Denitrifikation durch drei Parameter beeinflusst werden kann: durch die Art der Kohlenstoff-/Energiequelle, durch die vorhandenen Stickstoffquellen und durch das pH des Mediums.
Plastikmaterialien sind ubiquitär in Ökosystemen nachzuweisen; sie sind zumeist schlecht abbaubar, und Verwitterungsprozesse führen zu Fragmenten, die als Mikroplastik (MP) im Mikro m- bis mm-Bereich von Suspensions- und Sedimentfressern in Nahrungsnetze gelangen. MPs können aufgrund von Additiven per se toxisch sein, sie können aber auch persistente Substanzen (PPs) anreichern. Die Ziele von MiWa bestehen darin, (1) eine einheitliche Methodik zur Bestimmung der Abundanz von MP in Süßgewässern zu entwickeln, (2) verschiedene Umweltsysteme gezielt auf Quellen, Senken und den Verbleib von MPs zu untersuchen, sowie (3) toxikologische und ökotoxikologische Untersuchungen zu Effekten von MPs und PPs mit Testsystemen unterschiedlicher Komplexität und Trophiestufen durchzuführen. Ziel des Verbundes MiWa ist die nachvollziehbare und übergreifende Bewertung von MPs im Wasserkreislauf. Das Ziel des vorgeschlagenen Teilprojekts B4 besteht darin, den etablierten Modellorganismus Zebrabärbling (Danio rerio) für den Nachweis potentiell adverser Wirkungen von Mikroplastikpartikeln und partikelassoziierten Schadstoffen auf Fische zu etablieren, wobei aus Tierschutzgründen vor allem mit Embryonen gearbeitet wird. Die Wirkung von direkt aus dem Wasser aufgenommenen MPs und PPs wird mit der Aufnahme entlang von einfachen Modellnahrungsketten verglichen. Als weitere tierversuchsfreie Systeme werden Zellkulturen eingesetzt, um grundlegende Prozesse der Aufnahme und Wirkung von MPs und PPs zu verstehen. Die toxikologischen Endpunkte umfassen Embryo-, Neuro-, Cyto- und Gentoxizität sowie Teratogenität, Induktion von Cytochrom P450 und endokrine Wirkungen.
Zusammenfassung: In Fortsetzung der Thematik früherer Arbeiten, liefert das vorliegende Gutachten mit der Bereitstellung einer weiteren Methode zur Speziesidentifikation bei Fleisch und Fleischerzeugnissen, einen wesentlichen Beitrag zur Sicherung und Verbesserung der Qualität in der Lebensmittelproduktion. Die Gewinnung von Hunde- bzw. Katzenfleisch zum Genuss für den Menschen ist in Deutschland, abweichend von der Praxis in den meisten osteuropäischen Ländern, durch das Fleischhygienegesetz (FlHG) untersagt. Tierschutzrechtliche und ethische Gründe ebenso wie der gesundheitliche Verbraucherschutz (Trichinellosen) erfordern die Entwicklung adäquater Nachweisverfahren. Unter Verwendung universeller Primer wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein 981 Basenpaare (Bp) umfassender Abschnitt der zuvor isolierten Cytochrome B-mtDNS amplifiziert. Nach Abschluss von Sequenzierungsuntersuchungen konnten unter Einbeziehung des Computer-Programms 'Clone Manager' die Restriktionsendonukleasen Alu I und Hae III für eine Spezies-spezifische Restriktionsanalyse als besonders geeignet ausgewählt werden. Basierend auf der Sequenz des Cytochrome B-Gens und dem Alignment gegen die Gensequenz von fünf anderen fleischliefernden Tierarten, wurden die Spezies-spezifischen Primerpaare Dog F/Dog R und Cat F/Cat R entwickelt und in anschließenden Versuchsreihen etabliert. In hausinternen Blindversuchen konnte die molekuargenetische Identifizierung und Differenzierung aller untersuchten Matrizes reproduzierbar belegt werden. Der amtlichen Routinediagnostik steht somit eine hochauflösende und analytisch abgesicherte Feincharakterisierungsmethode zur Verfügung, die den Nachweis bis 0,01 Prozent an Hunde- bzw. Katzenfleisch in Fleischerzeugnissen, unabhängig von der Prozessierungsstufe, gewährleistet. Nach dem Kenntnisstand der Autoren ist bisher kein Verfahren zur Abgrenzung des Hunde- und Katzenfleischs von anderen fleischliefernden Tieren publiziert worden. Ausgangssituation und Problemstellung. Gemäß Paragraph 1 Abs.1 des Fleischhygienegesetzes (FlHG) darf das Fleisch von Affen, Hunden und Katzen nicht zum Genuss für den Menschen gewonnen werden. Nicht gesetzeswidrig wäre es jedoch, Hunde und Katzen zum Zwecke der Fellgewinnung und/oder für die Tierfutterproduktion zu schlachten (Blicke, 2001). In den meisten osteuropäischen Ländern, wie z.B. Rumänien, ist die Schlachtung von Hunden zum Zwecke der Ernährung des Menschen üblich und erlaubt. Abgesehen von tierschutzrechtlichen und ethischen Gründen, besteht ein gesundheitliches Gefährdungspotential, da eine Trichinenschau für die Tierart 'Hund' in vielen Ländern nicht vorgeschrieben ist. Die diesbezügliche aktuelle Situation im osteuropäischen Raum ist insgesamt sehr unübersichtlich. Hundeschlachtungen finden überwiegend als Hausschlachtungen statt und werden amtlicherseits nicht erfasst. ...
Ziel: Entwicklung eines humandiagnostischen Testverfahrens fuer Schadstoffexpositionen am Beispiel der Exposition gegenueber partikelgebundenen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK). Der Test beruht auf der Bestimmung eines Effektbiomarkers in Leukozyten. Versuchsansatz: - Schadstoffexposition durch orale Aufnahme PAK-kontaminierter Bodenpartikel im Tiermodell (Ratte). - Bestimmung der Induktion des schadstoffmetabolisierenden Cytochrom P450-Enzyms CYP1A1 als Biomarkereffekt in Leber und Leukozyten mit enzymatischen und immunchemischen Methoden. - Vergleich der Enzyminduktion mit den applizierten und in verschiedenen Geweben bestimmten PAK. - Vergleich der Enzyminduktion mit Ergebnissen oekotoxikologischer Testverfahren im Zuge der Risikoabschaetzung. - Automatisierung des Testsystems zur Analyse der CYP1A1-Induktion in Humanleukozyten. Ergebnisse: - Fuer die Analysen konnten monoklonale Antikoerper selektiert werden, die CYP1A1 spezifisch und speziesuebergreifend (Mensch, Ratte) erkennen. - Man erhaelt sigmoide Dosis-Wirkungs-Beziehungen zwischen der Induktion von lebermikrosomalem CYP1A1 und der aufgenommenen Schadstoffmenge (bezogen auf 5- und 6-Ring PAK). - Methodische Voraussetzungen zur Detektion von CYP1A1 in Leukozyten auf der Basis eines ELISA-Tests wurden geschaffen.
Im Rahmen der Novellierung des Arzneimittelgesetzes vom September 1998 und der anstehenden Umsetzung der EG-Biozid-Richtlinie in nationales Recht offenbart sich die Notwendigkeit gerade im terrestrischen Bereich, die Methodenentwicklung voranzubringen, da kaum geeignete Methoden vorhanden sind, um die gesetzlich vorgeschriebene Pruefung auf Umweltvertraeglichkeit zu realisieren. Ziel des FuE-Vorhabens ist es, Abhilfe zu schaffen und ein Testsystem zum Pruefen von Tier- und Humanarzneimitteln sowie von Bioziden auf ihre Umweltvertraeglichkeit im terrestrischen Bereich einzufuehren. In dem Vorhaben soll mit einem Vertreter der Invertebraten (Caenorhabditis elegans, Nematode, Bodenbewohner) die Steigerung der Entgiftungsleistung durch Chemikalien (gemessen als Induktion von Cytochrom P450 Genen) auf DNA-Ebene (auf der Stufe der m-RNA) untersucht werden. Das Genom von Caenorhabditis elegans ist vollstaendig sequenziert und zeigt im Bereich der Entgiftungsleistung viele Uebereinstimmungen zum Saeugergenom. Das Cytochrom P450 System ist ein zentrales Enzymsystem fuer die Entgiftung von Umweltschadstoffen, Medikamenten, Bioziden, etc. Die vermehrte Induktion von Cytochrom P450 Genen ist als Mass fuer den Stresszustand der Bodenbewohner infolge Schadstoffbelastung zu werten. Zusaetzlich soll die Induktion vor Hitzeschockgenen als Stressindikator erfasst werden. Parallel dazu werden herkoemmliche Reproduktionstests mit C. elegans im Boden-, Wasser- und Eluattestsystem durchgefuehrt, um vergleichende Aussagen ueber das Auftreten subletaler Effekte, d.h. die Vermehrung und Nachkommen betreffende Effekte, in umweltrelevanten Konzentrationen zu erhalten. Das Projekt soll in vier Phasen untergliedert werden: 1. Phase: Testung der biologischen Aktivitaet von einzelnen, umweltrelevanten Arzneimitteln und Bioziden auf DNA-Ebene und im Reproduktionstest. Vergleich der Ergebnisse. 2. Phase: Untersuchung weiterer Stressanzeiger im Genom von C. elegans. 3. Phase: Auswertung der ersten und zweiten Phase, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen aufzustellen. Diese sollen analysiert werden, um Geninduktionen, die fuer bestimmte Chemikaliengruppen spezifisch sind, zu erfassen. Die Ergebnisse sollen in einer Datenbank erfasst werden. 4. Phase: Validierung des Testsystems mit ausgesuchten Arzneimitteln und Bioziden.
Ziel des Projekts ist der Aufbau und die Evaluierung eines biotechnologischen Produktionsverfahrens zur fermentativen Synthese von Harzsäuren. Identifizierung, rekombinante Expression und Evaluierung geeigneter Enzyme zur Synthese von Harzsäuren bzw. entsprechender Ester aus GGPP. Relevante Enzymklassen sind Diterpen-Synthasen, spezifische Cytochrom-P450-Monooxygenasen, sowie Esterasen (Lipasen). Erfolgreich getestete Einzelenzyme der verschiedenen Klassen werden dann zur Implementierung und Testung eines synthetischen Stoffwechselwegs verwendet. Bei erfolgreichem Nachweis der Produktbildung erfolgt im Anschluss die Ausbeuteoptimierung des Verfahrens über geeignete Stammentwicklung (i.a. Feinabstimmung der Enzymaktivitäten, Einsatz von Helferproteinen). Weitere Arbeiten widmen sich der Evaluierung von Möglichkeiten zur gezielten Herstellung neuartiger Produktqualitäten über die Koexpression weiteren Enzyme. Die gezielte Erzeugung von Harzsäuregemischen definierter Zusammensetzung und insbesondere auch die bio-katalytischen Herstellung von Harzsäure-Estern steht hier im Fokus.
Der zentrale Ostatlantik ist eine der wichtigsten Fisch-Herkunftsregionen für den europäischen Markt, darunter auch für Deutschland (Brashares et al. 2004). Dementsprechend wurden die Fangmengen seit 1950 etwa um das 10fache gesteigert, verbunden mit einem Rückgang von Beständen sowohl in Küstengewässern als auch offshore (FAO 2007). Neben einigen anderen Nationen sind vor allem EU-Fischereifahrzeuge in westafrikanischen Gewässern präsent (Kaczynski and Fluharty 2002). Die im Vergleich zu Gewässern der gemäßigten Breiten hohe Artenvielfalt und das häufige Fehlen jeglicher Fischereikontrollen führt immer wieder zur Fehldeklaration von importierten Fischereiprodukten. Um die vorgeschriebenen Handelsbezeichnungen effektiv überprüfen zu können, müssen zum einen geeignete Nachweisverfahren vorhanden sein und zum anderen notwendige Vergleichsdaten oder Standards, d.h. Referenzfische zur Verfügung stehen. Durch Forschungsarbeiten der vergangenen Jahre stehen dem Max Rubner (MRI)- und Thünen-Institut (TI) geeignete genetische Nachweisverfahren zur Verfügung, die eine Identifikation hinsichtlich der Fischart sicher ermöglichen. Das Thünen-Institut für Fischerökologie verfügt aufgrund ausgedehnter Sammlungstätigkeit der letzten zehn Jahre über ausreichend Probenmaterial der wichtigsten kommerziell genutzten westafrikanischen Arten, die es erlauben, erstmalig eine Referenzdatenbank aufzubauen, die sowohl für die Veterinär- und Verbraucherschutzbehörden des Bundes als auch der Länder von erheblichem Nutzen wäre. Ziel dieses Arbeitspaketes ist es, gemeinsam mit der Firma Impetus GmbH & Co aus Bremerhaven eine umfangreiche und international abrufbare Datenbank zur Identifizierung und Rückverfolgbarkeit von westafrikanischen Fischarten und daraus hergestellten Fischerzeugnissen mittels molekularbiologischer Nachweisverfahren zu erstellen. Die Genamplifikation erfolgt mittels universeller Primer, die in zahlreichen Fischtaxa verwendet wurden. Insgesamt sollen vier Gene von ca. 400 Fischarten amplifiziert werden. Das MRI wird das 389 Nukleotid umfassende DNA-Segment aus dem Rhodopsingen RH1 amplifizieren und sequenzieren. Das Arbeitspaket des TI beinhaltet die PCR-Amplifikation und teilweise Sequenzierung bestimmter Abschnitte der mitochondrialen Gene Cytochrom-c-Oxidase I (COX) und Cytochrom b (Cytb) sowie eines nukleären Gens. Zusätzlich erarbeiten das TI und Impetus GmbH & Co gemeinsam mit dem Centre for Ecological and Evolutionary Synthesis der Universität Oslo in einem Next-Generation-Sequencing-Verfahren SNP-Marker zur Entwicklung eines Herkunftsnachweises auf Basis einer SNP-chip-Technologie für den Gelbflossenthun (Thunnus albacares).
Das Projekt erschließt neuartige Grundlagen für die Nutzung pflanzlicher Enzymsysteme in industriellen Produktionssystemen. AELMON ist das Akronym für 'Artifizieller ELektronentransfer und pflanzliche Monooxygenasen als Basis innovativer Katalysesysteme'. Der wissenschaftliche Hintergrund ist die industrielle Nutzung einer Familie von Pflanzenenzymen - den so genannten P450-Enzymen, deren herausragende Eigenschaften schon seit langem bekannt sind, die sich aber bisher nicht wirtschaftlich für chemische Synthesen einsetzen lassen. 'Durch die Mitarbeit in diesem Projekt kann sich die Autodisplay-Technologie weiter als Lösungsansatz für die Darstellung schwierig zu handhabender Enzyme wie den P450-Enzymen positionieren,' sagt Dr. Ruth Maas, Geschäftsführerin der Autodisplay Biotech. Das Projekt stellt für die Firmenstrategie der Phytowelt, Know-how der Pflanzenbiotechnologie für neue, zum Teil überraschende Anwendungsgebiete einsatzfähig zu machen, einen wichtigen Meilenstein dar. 'Die spezielle Thematik besetzt die Schnittstelle zwischen Grüner und Weißer Biotechnologie und hat das Potenzial, völlig neue Wertschöpfungsketten zu erschließen,' kommentiert Dr. Peter Welters, Geschäftsführer der Phytowelt das Projekt. Ein wesentlicher Schwerpunkt der im Projektrahmen zu untersuchenden Systeme ist die Biosynthese eines Terpens, dessen potente pharmakologische Eigenschaften es bereits in den Fokus der Krebsforschung gerückt haben. Ein weiteres Teilprojekt wird die Untersuchung neuer Synthesemethoden von Grundbausteinen für innovative Kunststoffe mit Premiumeigenschaften sein. Besonderes Innovationspotenzial bezieht AELMON aus neuartigen Verfahren zur Produktion der P450-Enzyme bei den Partnern Uni Münster und AutoDisplay, aber auch aus der geplanten Entwicklung eines neuen biotechnologischen Verfahrens unter Einsatz der Elektrochemie. Die Kombination von Elektrochemie und Biokatalyse stellt einen Forschungsschwerpunkt der DECHEMA dar, der das Design besonders nachhaltiger Produktionsprozesse mit P450-Monooxygenasen zum Ziel hat.
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