Development of insecticide resistance in insect pest species is one of the main threats of agriculture nowadays. The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is the noctuid species possessing by far the most reported cases of insecticide resistance worldwide, correlated with one of the widest geographical distributions of any agricultural pest species. This turns H. armigera into an adequate model to study resistance mechanisms in detail. The main mechanisms underlying insecticide resistance are target side insensitivity and metabolism, mainly due to carboxylesterases and cytochrome P450 monooxygenases. Just recently, the resistance mechanism of an Australian H. armigera strain toward the pyrethroid fenvalerate was ascribed to a single P450, CYP337B3. CYP337B3 is a naturally-occurring chimera between CYP337B2 and CYP337B1 evolved by an unequal crossing-over event. This enzyme had acquired new and exclusive substrate specificities resulting in the detoxification of fenvalerate. This is the first known case of recombination as an additional genetic mechanism, besides over-expression and point mutation, leading to insecticide resistance. Therefore, CYP337B1, CYP337B2, and CYP337B3 are ideal candidates for studying structure-function relationships in P450s. The project aims to characterize amino acids that are crucial for the activity of CYP337B3 toward detoxification of fenvalerate. Additionally, cross-resistance conferred by CYP337B3 enables the determination of common structural moieties of pyrethroids favoring detoxification by CYP337B3 and those leading to resistance breaking. Pyrethroids with identified resistance breaking moieties could be used to control even pyrethroid-resistant populations of H. armigera. Another advantage of this system is the conferment of insecticide resistance by CYP337B3 that is not restricted to Australia but seems to be a more common mechanism as recently revealed by the finding of the chimeric P450 in a cypermethrin-resistant Pakistani strain. To shed light on the contribution of CYP337B3 to pyrethroid resistance of H. armigera and even closely related species worldwide, field populations from different countries will be screened by PCR for the presence of CYP337B3 and its parental genes. If applicable, the allele frequency of CYP337B3 will be determined being a convenient method to conclude the resistance level of the tested populations. Finally, the project will result in advising farmers on the control of populations of H. armigera and related species possessing CYP337B3. This will even become more important due to the climate change allowing H. armigera to spread northward including central Europe, where H. armigera is not yet able to survive wintertime.
Die Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen wurde am Beispiel von Transienten zwischen oxischem und denitrifizierendem Wachstum von Paracoccus denitrificans studiert. Bei solchen Wechseln muss die membrangebundene Elektronentransportkette jeweils den neuen Bedingungen angepasst werden. Diese Vorgaenge wurden anhand der Aenderungen in der Zusammensetzung der Cytochrome analysiert. Im weiteren wurde auch den Endprodukten der Denitrifikation besondere Beachtung geschenkt. Es zeigte sich, dass das Verhaeltnis zwischen molekularem Stickstoff und Lachgas bei der Denitrifikation durch drei Parameter beeinflusst werden kann: durch die Art der Kohlenstoff-/Energiequelle, durch die vorhandenen Stickstoffquellen und durch das pH des Mediums.
Plastikmaterialien sind ubiquitär in Ökosystemen nachzuweisen; sie sind zumeist schlecht abbaubar, und Verwitterungsprozesse führen zu Fragmenten, die als Mikroplastik (MP) im Mikro m- bis mm-Bereich von Suspensions- und Sedimentfressern in Nahrungsnetze gelangen. MPs können aufgrund von Additiven per se toxisch sein, sie können aber auch persistente Substanzen (PPs) anreichern. Die Ziele von MiWa bestehen darin, (1) eine einheitliche Methodik zur Bestimmung der Abundanz von MP in Süßgewässern zu entwickeln, (2) verschiedene Umweltsysteme gezielt auf Quellen, Senken und den Verbleib von MPs zu untersuchen, sowie (3) toxikologische und ökotoxikologische Untersuchungen zu Effekten von MPs und PPs mit Testsystemen unterschiedlicher Komplexität und Trophiestufen durchzuführen. Ziel des Verbundes MiWa ist die nachvollziehbare und übergreifende Bewertung von MPs im Wasserkreislauf. Das Ziel des vorgeschlagenen Teilprojekts B4 besteht darin, den etablierten Modellorganismus Zebrabärbling (Danio rerio) für den Nachweis potentiell adverser Wirkungen von Mikroplastikpartikeln und partikelassoziierten Schadstoffen auf Fische zu etablieren, wobei aus Tierschutzgründen vor allem mit Embryonen gearbeitet wird. Die Wirkung von direkt aus dem Wasser aufgenommenen MPs und PPs wird mit der Aufnahme entlang von einfachen Modellnahrungsketten verglichen. Als weitere tierversuchsfreie Systeme werden Zellkulturen eingesetzt, um grundlegende Prozesse der Aufnahme und Wirkung von MPs und PPs zu verstehen. Die toxikologischen Endpunkte umfassen Embryo-, Neuro-, Cyto- und Gentoxizität sowie Teratogenität, Induktion von Cytochrom P450 und endokrine Wirkungen.
Erster Abschnitt (1.10.89-31.12.91): a) Auswirkungen von TCDD auf die Oogenese laichbereiter Weibchen von Brachydanio (Laicherfolg, Befruchtungsrate, Ontogenese); b) Auswirkungen einer Kontamination von Eiern und Embryonen; c) Aufnahme, Verbleib und Ausscheidung von TCDD (radioakt mark Substanz) an laichenden Fischen; d) Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme (P-450) nach Belastung adulter Brachydanio mit TCDD. Zweiter Abschnitt (1.1.-31.12.92): a) Weitergabe von TCDD ueber Fischnaehrtiere an Fische; b) Auswirkungen von TCDD auf die Spermiogenese, Befruchtungsrate und Verhalten der Spermien; c) Pruefung eines moeglichen Biomonitoring (Induktion P-450) an Fischen aus verschiedenen Teilen des Landes. An Zebrabaerblingen wurden die toxischen Auswirkungen von 2,3,7,8-TCDD auf die Fortpflanzung und Oogenese untersucht. Die Fische erhielten mit der Nahrung jeweils 1,5,10 oder 20 ng/Fisch verabreicht. Bei Konzentrationen von mehr als 5 ng war das Ablaichen stark beeintraechtigt oder wurde ganz eingestellt. Die Zahl der abgelegten Eier sank stark ab. Die behandelten Weibchen zeigten ein wasting-syndrom (vermindertes Koerpergewicht). Bei den Embryonen entstanden letale Anomalien (100 Prozent Mortalitaet). Die Entwicklung reifer Oozyten unterblieb und die Zahl der atretischen Follikel nahm zu. Die Elimination und Verteilung von (3H)-TCDD in en Organen und Geweben des Zebrabaerblings wurde ueber eine Zeitspanne von 70 Tagen ermittelt. Waehrend in allen anderen Organen Belastungsmaxima nach 1 bis 8 Tagen erreicht wurden mit nachfolgender Elimination, stieg die Belastung der Ovarien bis zum siebzigsten Tag stetig an und erreichte ein Drittel der Gesamtbelastung des Fisches. Diese Belastung wurde abgebaut ueber die Gelege; nach 4 Gelegen hatten die Fische ca 50 Prozent der Belastung abgegeben. Bei TCDD-Konzentrationen von 1,5 und 15 ng/Fisch kam es zu zahlreichen 'Gelegeausfaellen'. Als Ursache werden Stoerungen der Oogenese durch TCDD vermutet. Untersuchungen zum Fremdstoffmetabolismus zeigten, dass Zebrabaerblinge auf TCDD mit einer starken Induktion des Cytochrom P450-Isoenzyms LM4B reagieren. Dies wurde in aehnlicher Weise schon mit verwandten Verbindungen bei anderen Fischarten beobachtet. Die Weitergabe von (3H)-TCDD in der Nahrungskette wurde in einem Modellversuch geprueft. Dazu wurde verwendet: Kontaminiertes Fallaub der Schwarzerle, Bachflohkrebse, die sich von diesem Fallaub ernaehren, und junge Regenbogenforellen, die diese Krebschen gezielt fingen. Die Ergebnisse zeigen, dass es ueber die ausgenommenen Fischnaehrtiere rasch zu einer Anreicherung von TCDD im Organismus kommt. Die Verteilung im Fischkoerper entspricht bereits innerhalb von 8 Tagen der Verteilung nach langfristiger und unterschiedlicher Exposition. Die Ergebnisse sind von Bedeutung fuer die Bewertung der Dioxinwirkung: Die gemessenen Wirkkonzentrationen liegen um mehrere Groessenordnungen unter den bekannten Lethalkonzentrationen...
Das Vorhaben bedient sich der Induktion der Cytochrom P450 (CYP) 1 A-katalysierten 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase-Aktivitaet in Zellkulturen als Parameter fuer die Aktivierung des Dioxinrezeptors. Dieses Verfahren ist zur Erfassung der Wirkung einzelner polychlorierter Dibenzo-p-dioxine (PCDDs) und verwandter Dioxinrezeptor-Agonisten bereits etabliert und wurde erfolgreich in Hepatomzellen und Hepatozyten der Ratte, sowie in menschlichen Hepatomzellen zur Beurteilung der Wirkung und Potenz komplexer PCDD-Gemische eingesetzt. Im laufenden Projekt sollen organische Extrakte aus mit PCDDs und verwandten Schadstoffen belasteten Proben (Flugasche, Boden etc.) als Induktoren eingesetzt werden. Aus den Konzentrations-Wirkungs-Kurven sollen Rueckschluesse auf den Gehalt an Dioxinrezeptor-Agonisten gezogen werden. Die Extrakte werden parallel chemisch auf potente PCDDs, polychlorierte Dibenzofurane (PCDFs) und Biphenyle (PCBs) analysiert. Besonderes Gewicht soll auf die Aussagekraft und moegliche Stoeranfaelligkeit des Bioassays gelegt werden.
Ziel des Verbundprojekts ist die Entwicklung eines technisch umsetzbaren biotechnologischen Prozesses zur Synthese von omega-Carboxyalkoholen und omega-Carboxyaminen, insbesondere von omega-Aminolaurinsäure aus dem allgemein verfügbaren Laurinsäuremethylester. Eine wesentliche Rolle für die regiospezifische Funktionalisierung eines Alkans bzw. einer Carbonsäure spielen hier zwei Enzyme: eine Monoxygenase und eine Transaminase. Für diese beiden Reaktionsschritte zuvor identifizierte Biokatalysatoren mit initialer Substraterkennung (z.B. AlkBGT und pQR800) sollen mit gentechnischen Methoden dargestellt sowie biochemisch und strukturell charakterisiert werden. Zudem soll durch Protein-Engineering eine Optimierung hinsichtlich der industriell relevanten Substrate vorgenommen und eine gekoppelte Reaktionskette in vitro etabliert werden. Pilze insbesondere der Gattung Candida besitzen bereits die Fähigkeit, mit Hilfe sehr effizienter Cytochrom-P450-Monoxygenasen über die so genannte omega-Oxidation aus Fettsäuren alpha,omega-Dicarbonsäuren herzustellen, aus denen omega-Aminocarbonsäuren leicht zugänglich sind. Daher sollen die relevanten Enzyme rekombinant hergestellt, charakterisiert und zur biotechnologischen Produktion von hydroxylierten Fettsäuren eingesetzt werden.
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Täglich werden neue Wirkstoffe und Chemikalien für die Förderung der Gesundheit bzw. Bekämpfung von Krankheiten und die Befriedigung verschiedenster anderer menschlicher Bedürfnisse entwickelt und neu in den Verkehr gebracht. Jeder dieser Stoffe bringt aber auch ein mehr oder weniger großes Gesundheits- und Umweltrisiko mit sich. Aus diesem Grund gibt es ein breites Spektrum von Methoden, mit denen erwünschte und unerwünschte Wirkungen von Wirkstoffen und Chemikalien und deren Metabolismus untersucht werden. In vielen Bereichen müssen für derartige Untersuchungen immer noch umstrittene Tierversuche durchgeführt werden. Sehr frühe und kostengünstige Studien vermindern Entwicklungsrisiken ökonomischer, ökologischer und sozialer Art. Im vorliegenden Projekt werden Mikrotiterplattenreaktoren mit integrierten optischen Sensoren für Sauerstoff sowie auf Respirationsmessungen beruhende Methoden zur Untersuchung des Metabolismus und der Toxizität von Wirkstoffen entwickelt. Fazit In der hier vorliegenden Studie ist es erstmals gelungen, eine 96-well-O2-Sensorplatte mit Flachboden zu entwickeln, welche zur Kultur adhärenter Zellen geeignet ist. Sowohl Zelllinien als auch primäre Zellen können auf der Platte kultiviert werden und zur Sauerstoffmessung herangezogen werden. Die Sauerstoffmessung liefert Daten über die Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen und kann zur Bestimmung der Toxizität neuer Wirkstoffe eingesetzt werden. Die erhaltenen Sauerstoffdaten während der Kultur der proliferierenden Zelllinien korrelieren gut mit Daten, die mit einem konventionellen MTT-Test erhalten wurden und können somit zur Bestimmung der Lebensfähigkeit verschiedener Zellen herangezogen werden. Die in dieser Studie erstmals etablierte Kultur adhärenter Zellen auf O2-Sensorplatten erlaubt auch die Bestimmung der Toxizität neuer Wirkstoffe auf unterschiedlichste Zelltypen. Über die ursprünglich vorgesehenen Arbeiten hinaus wurde eine Medienoptimierungen für CHO in MTP erfolgreich durchgeführt. Die Sauerstoffmessung zum metabolischen Abbau von Substraten in MT-Platten mit Sauerstoffsensor zeigte für gepoolte Mikrosomen eine Machbarkeit der Verfolgung der Abbaureaktionen. Gleichzeitig traten auf-grund der unkontrollierten Nebenreaktionen viele Störfaktoren auf. Erste orientierende Studien mit isolierten Cyps (z.B. Cyp3A4) deuten auf eine Lösung unter dem Aspekt der Störfaktoren/Nebenreaktionen hin.
Microarrays: Entwicklung der molekularen Diagnostik auf der Basis von Microarrays. Dadurch soll die Diagnose von agronomisch relevanten Organismen vereinfacht und die Kapazität einzelner Labors erhöht werden. Mehrere relevante Schadorganismen sollen auf einem Microarray identifiziert werden können. Indikatoren: 1) Das Potenzial des Random Chip Prinzips ist abgeklärt. 2) Ein funktionsfähiger Chip mit mind. 50 ökonomisch relevanten Insekten. Marker: Mit Strategie 1) Entwicklung von molekularen Markern für Pestizidresistenzen bei Cydia pomonella. Primäres molekulares Ziel ist die Genfamilie Cytochrom P450, die nachweislich bei Insekten für Resistenz gegen Pestizide verantwortlich ist. Sekundäres molekulares Ziel sind anonyme Marker (mit ALFP, RAPD, Mikroarrays). Indikator: Mindestens ein Gen und/ oder Marker sind entwickelt. Mit Strategie 2) Erhebung von epidemiologischen Daten über die Dynamik von Pestizidresistenzen (inkl. multiplen Resistenzen). Die epidemiologischen Daten ergeben ein detailliertes Bild der Häufigkeit und Ausbreitung von Pestizidresistenzgenen. Indikator: Daten zu Häufigkeit und Verbreitung des entsprechenden Gens in mind. 3 wichtigen Schweizer Anbaugebieten wurden etabliert.
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