Veranlassung
Mit der sogenannten ‘effektdirigierten Analytik’ sollen Substanzen, die möglicherweise schädliche Wirkungen auf Mensch und Umwelt haben, in komplexen Umweltproben wie z.B. Abwasser identifiziert werden. Grundsätzlich wird dies durch eine chemische Trennung der Probe und eine Testung der gewonnenen Fraktionen auf Schadwirkungen mit einer sich anschließenden chemischen Analytik erreicht. Vor diesem Hintergrund arbeiten die Hebrew University Jerusalem und die BfG gemeinsam an der Entwicklung neuartiger Werkzeuge zum Nachweis von Schadstoffen in der Umwelt. Die Grundidee besteht in einer direkten Kopplung von Dünnschichtchromatographie mit biologischen und chemischen Nachweismethoden.
Durch die Nutzung spezifischer biologischer Verfahren z.B. zur Erkennung hormonell aktiver Substanzen werden alle Stoffe in einer Probe erkannt, die diese, in der Umwelt unerwünschte, Eigenschaft haben - dies schließt z.B. unbekannte Umwandlungsprodukte mit entsprechender biologischer Wirkung mit ein. Die so nachgewiesenen Substanzen können anschließend durch chemische Methoden identifiziert werden.
Ziele
Es wird ein Ansatz entwickelt, die Quellen und die Verteilung von Mikroverunreinigungen - basierend auf einer Analyse biologischer Wirkungen in direkter Kopplung mit chemischen Trennverfahren - zu charakterisieren.
- Etablierung von Verfahren zur Detektion von adversen Endpunkten auf der Oberfläche von Dünnschichtplatten (z.B. östrogene, androgenegentoxische und dioxinähnliche Wirkungen).
- Entwicklung neuer Sensorstämme zur parallelen Detektion mehrerer der oben genannten Endpunkte
- Entwicklung massenspektrometrischer Verfahren zur nach-dünnschichtchromatographischen Trennung
Durch den Menschen wird eine Vielzahl von Substanzen - beabsichtigt und unbeabsichtigt - in die Umwelt eingetragen. Eine umfassende Überwachung eingetragener Verbindungen durch eine gezielte chemische Analyse ist nicht möglich, nicht zuletzt, weil Stoffe in der Umwelt verschiedensten Umwandlungsprozessen unterliegen. Dadurch können unbekannte Umwandlungsprodukte entstehen, die sich den gängigen Messmethoden entziehen, aber durchaus nachteilige Auswirkungen auf Mensch und Umwelt haben können.
Verfolgung von Effekten subterraner organischer Mikroverunreinigungen Durch den Menschen wird eine Vielzahl von chemischen Stoffen freigesetzt, die für Mensch und Umwelt schädlich sein können. Meist ist aber nur ein geringer Anteil dieser schädlichen Stoffe bekannt. In dem Projekt werden daher Verfahren zur Erkennung unbekannter Schadstoffe entwickelt.
Aim: Valorisation of side-streams of the Citrus industry using the genetic diversity of monokarya from the basidiomycete Pleurotus sapidus. The genetic diversity of the basidiospores of Pleurotus sapidus (MKs) obtained from two dikaryotic strains of P. sapidus (Dk421 and Dk3174) will be exploited. Mks with high growth rate on milled Citrus peel, pulp and seed of orange, tangerine, lemon will be selected and grown as solid state and submerged fermentation (SF). Metabolites will be extracted and evaluated for biological activities. Samples before and after the fungal transformation taken from SSF and SF cultures will be analysed. Rapid product analyses using TLC and established coupled HPLC-DAD-ELSD will focus on the most promising strains. Specific targets are flavonoids with an increased number of hydroxyl groups on the B-ring, unsaturated carbonyls and terpenoids from the oxo-functionalisation of limonene, citronellal and farnesene isomers. High resolution and multi-dimensional GC-MS and multireaction monitoring (varying MS collision energies) will be used. Extracts from various strain/culture combinations (SSF or SF) will be lyophilized. One fraction of each sample will be tested for its biopesticide action, and another one for its quality as a feed supplement. SSF will be carried out in a rotary drum solid-substrate fermentation system.
The project is comprised of seven major work packages: 1. Generation and selection of the monokaryons (CITER) 2. Growth of the monokaryons (CITER) 3. Selection of the optimal culture conditions to obtain bioactive compounds using the selected Mk form step 2. (CITER, LUH, JLU, JUB) 4. Analytical evaluation of the biotransformation/conversion products (LUH, JLU) 5. Automated screening of Mks by chiral GC-GC (JLU) 6. Bioactivity test of crude extracts obtained from SSF and SF (IMBIV, IIB) 7. Bioprocess design and scale-up (JLU, JUB).
Das Xyloglucan (XG) der Hemicellulose von Pflanzen ist ein häufiges, komplex verzweigtes Polysaccharid und eine wertvolle Zuckerquelle für die Biotechnologie. Sein Abbau setzt die Anwesenheit einer Reihe von verschiedenartigen Enzymen voraus, deren Identitäten und Aktivitäten aufgeklärt werden. Durch die Durchmusterung thermophiler Organismen mit bekannter Genomsequenz auf effizienten XG-Abbau und Klonieren ausgesuchter, potentiell am Abbau beteiligter Gene wird in vitro eine rekombinante kooperative Enzym-Toolbox für den vollständigen Abbau von XG zusammengestellt. Die Bestimmung der Substratspezifitäten und Charakterisierung der Enzyme erfolgt mit Hilfe eines colorimetrischen Aktivitätsassays, die Produktanalyse wird mit Dünnschichtchromatographie und HPLC/HPAEC durchgeführt. Parallel wird durch die Entwicklung eines neuen Vektorsystems, das mit einem selektierbaren Marker, einem regulierbaren Promotor und weiteren Hilfsfunktionen ausgestattet ist, die Voraussetzung für eine effiziente rekombinante Produktion der enzymatischen Komponenten in einem bakteriellen Expressionswirt erarbeitet. Die Eignung des Vektorsystems für industrielle Produktionsbedingungen wird anhand eines Beispiel-Gens in einem anderen Projekt (FKZ: 031A555, Dr. Schwarz) optimierten bakteriellen Produktionswirt getestet und dann zur Produktion der ausgewählten Xyloglucanase-Genen verwendet. Die Ergebnisse werden mit den im russischen Parallelprojekt produzierten Oligosacchariden aus pilzlichen Enzymen verglichen und gemeinsam analysiert.
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Aufgrund seines breiten Substratspektrums nimmt das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii (vormals bogoriae) eine Sonderstellung unter allen extremophilen Mikroorganismen ein und verfügt über eine Fülle von biotechnologisch interessanten Enzymen. Ziel des Projekts war es, durch den Einsatz von Biokatalysatoren aus diesem Mikroorganismus nachwachsende Rohstoffe wie Stärke bzw. Amylopectin und Amylose zu hochwertigen Kohlenhydraten (Cyclodextrine, verzweigte Dextrine und Oligosaccharide) umzusetzen. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden: Das Genom des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii wurde zunächst partiell sequenziert. Ziel des Teilprojekts war es, unter geringstem möglichem Aufwand und innerhalb kürzester Zeit alle oder möglichst viele Gene des Kohlenhydratstoffwechsels zu identifizieren. Die partielle Genomanalyse erfolgte über eine so genannte shotgun-Seqenzierung. Dabei wurde die genomische DNA mechanisch geschert, kloniert und an den Fragmentenden sequenziert. In 14.865 Sequenzierungsansätzen wurden 11.634 brauchbare Sequenzen mit einer Rohsequenz von 11,97 Mbp generiert. Die produzierten Sequenzfragmente wurden in einer Datenbank zusammengefasst und assembliert. Anschließend erfolgte die bioinformatische Auswertung über eine automatisch vorgenommene und manuell nachbearbeitete Annotation. Sequenzlücken in biotechnologisch relevanten Genen wurden durch Primerwalking geschlossen. Den Projektteilnehmern wurden Passwortgeschützte Zugangsrechte auf den die Sequenzinformationen enthaltenen Server eingerichtet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation wurden Gene ausgewählter Kohlenhydrat-metabolisierender Gene kloniert und exprimiert und die rekombinanten Enzyme gereinigt. Die Substrat- und Produktspektren dieser Enzyme wurden mittels HPLC, High performance anion exchange chromatography (HPAEC), Dünnschichtchromatographie (DC) und size exclusion chromatography (SEC) charakterisiert. Um die Thermostabilität der CGTase zu erhöhen, wurden über Errorprone PCR Mutationen in das die CGTase kodierende Gen eingeführt und die mutierten Gene anschließend über DNA-shuffling neu rekombiniert. Die Genbank erhaltener, mutierter CGTase-Varianten wurde auf erhöhte Thermostabilität gescreent. Zur Abschätzung der Thermostabilität wurde die Schmelztemperatur verschiedener Mutanten mittels differential scanning calorimetry (DSC) bestimmt. Des Weiteren wurde ein System zur Tat-abhängigen heterologen, sekretorischen Expression etabliert. Dies geschah über die Herstellung von Fusionsgenen aus biotechnologisch interessanten Genen von A. gottschalkii und verschiedenen Signalsequenzen.