Das Gesamtziel des Vorhabens liegt in der Erforschung des Zusammenhangs zwischen einer genetischen Prädisposition und der Entstehung von Krebs im Kindesalter. Schwerpunkt von AP5 und AP6 ist es, zelluläre Untersuchungen mit molekularen Analysen zu komplementieren, um einen tieferen Einblick in die einer Tumorentstehung zugrunde liegenden molekulargenetischen Ursachen zu erlangen. Dabei wird untersucht, inwieweit sich Checkpoint- und Reparaturkapazität genetisch im Hinblick auf die Krebsentstehung vorbelasteter Personen von gesunden Personen unterscheidet. Genomische Analysen sollen Einblick in mögliche Ursachen der Krebsentstehung liefern. Die Arbeitsschritte (Rekrutierung der Probanden, Etablierung der Zelllinien, molekulare/zelluläre Untersuchungen) werden von verschiedenen Arbeitsgruppen durchgeführt, die eng verzahnt arbeiten. Schließlich sollen die Daten der verschiedenen Endpunkte korreliert und gemeinsam veröffentlicht werden. AP5: Im Rahmen des ISIMEP-Projekts wurden Zelllinien aus Biopsien von Patienten mit Zweittumor nach Ersttumor im Kindesalter und Zelllinien aus Biopsien von Patienten mit Ersttumor im Kindesalter ohne Zweittumor auf ihre Checkpoint- und Reparaturkapazität untersucht. Diese Untersuchungen werden nun an 20 neu etablierten, gematchten Kontrollzelllinien durchgeführt. Von allen 60 Zelllinien sollen molekulargenetsiche Analysen durchgeführt und evtl. vorliegende genomische Auffälligkeiten in Genen der DNA-Reparatur oder Zellzykluskontrolle mit dem zellulären Verhalten korreliert werden. Auffällige Zelllinien werden schließlich eingehenden Reparatur- und Zellzyklusstudien unterzogen. AP6: Die im Rahmen von AP2 rekrutierten ca. 300 Zelllinien aller drei Patientengruppen werden mit den bereits etablierten Screening-Verfahren auf ihr Zellzyklus- und Reparatur-Verhalten nach hohen und nach niedrigen Dosen untersucht. Die Daten werden statistisch ausgewertet und mit den epidemiologischen und genomischen Daten korreliert.
Das Hauptziel des Vorhabens ist die Aufklärung der grundlegenden Mechanismen der frühen Prozessierung heterochromatischer DNA Schäden, um so die zellulären Auswirkungen einer fehlerhaften Reparatur im HC besser abschätzen zu können. Im Besonderen soll die Rolle der nach Ionenbestrahlung in Heterochromatin gefundenen lokalen Dekondensation und Relokalisation der Schäden in der Reparatur untersucht werden. Verschiedene Schwerpunkte des Einflusses der Schadenskomplexität auf die Prozessierung von DNA DSBs im Kontext der Kernarchitektur werden im Verbund von einem HGF Laboratorium und zwei universitären Partnern bearbeitet. Die räumliche und zeitliche Koordination von Reparaturfaktoren an DNA Schäden nach Röntgen - bzw. dicht ionisierenden Teilchenstrahlen wird an den Strahlplätzen der GSI mit innovativsten Bestrahlungstechnologien und hochauflösender Lebendzell-Mikroskopie untersucht. Parallel verlaufende molekularbiologische Arbeiten erlauben einen Einblick und auch einen Eingriff in die molekularen Abläufe der frühen Prozessierung. Neue Fluoreszenztechniken wie z.B. FLIM (fluorescence lifetime imaging) werden am Strahlplatz etabliert um dynamische Prozesse der lokalen Schadensantwort im Kontext der Chromatinstruktur zu messen.
Microbeams erlauben die gezielte Untersuchung der Interaktion von DNA Schäden verschiedener Teilchenspuren. Die wichtige Rolle geclusterter Schäden für den biologischen Effekt ist hinreichend belegt, die mikroskopische Beschreibung jedoch unklar. Das Local-Effect-Model (LEM) beinhaltet eine mechanistische Beschreibung der Schadensinteraktion und ihren Einfluss auf Zell- bzw. Gewebeschädigung. Ein Vergleich der Vorhersagen mit Zellüberlebensmessungen verspricht daher, Modellvorstellungen konkret prüfen zu können. Im Projekt werden Modellvorstellungen präzisiert werden, die eine zuverlässige Beschreibung der RBW erlauben. Die Arbeiten umfassen Erweiterungen des LEM im Hinblick auf die experimentellen Vorhaben an SNAKE. Darauf aufbauend werden Simulationsrechnungen durchgeführt, um experimentelle Bedingungen auszuwählen, die besonders sensitiv auf die jeweiligen spezifischen Modellannahmen sind. Im Rahmen des Vergleichs mit dem PARTRAC-Modell werden auch Sensitivitätsanalysen für eine Fehlerabschätzung durchgeführt. Die 2. Projekthälfte wird zur Modellentwicklung auf Grund gewonnener Daten verwendet.
Das Ziel des Projektes ist es, den COMET Assay zum Nachweis gentoxischer Schäden in 3D Hautmodellen zu etablieren und die Robustheit dieser Methode zu prüfen. Dies geht einher mit der Untersuchung möglicher DNA- Reparaturmechanismen in den 3D- Hautmodellen. Im Anschluss an das Hautmetabolismusprojekt, soll die metabolische Kompetenz der 3D Modelle weiter komplettiert werden. In Teilaufgabe 1 werden 20 bekannte Testsubstanzen von drei verschiedenen Laboreinheiten mittels COMET Assays an zwei Vollhautmodellen getestet. Die Durchführung erfolgt in drei Phasen. Nach jeder Phase werden die erzielten Ergebnisse verglichen und bei guter Übereinstimmung die nächste Prüfphase eingeleitet. In Teilaufgabe 2 soll die metabolische Kompetenz der Hautmodelle weiter ausgeführt werden. In Teilaufgabe 3 wird die DNA-Reparaturkapazität der Hautmodelle untersucht.
Ziel des vorliegenden Projektes ist es den Einfluss der Chromatinstruktur auf die Funktion des B-NHEJ zu untersuchen und zu testen inwiefern die starke Einschränkung dieses Reparaturweges, die in G0 Zellen beobachtet wird, auf die Kondensierung des Chromatins zurückzuführen ist. Folgende Aspekte werden untersucht: Die Kondensierung des Chromatins in G0 Zellen durch DAPI Färbung in Kombination mit quant. Bildanalyse. Der Einfluss von Änderungen der Chromatinstruktur durch hypotonische Behandlung auf den B-NHEJ in G0-Zellen. Die Zusammenhänge zwischen Änderung der DNA Methylierung und Chromatin Kondensierung. Dafür wird die Behandlung mit 5-Aza-C durch DAPI Färbung und Messung der B-NHEJ Aktivität optimiert. Unter optimierten Bedingungen wird die DNA Methylierung mittels Elisa bestimmt, durch Sequenzierung von Bisulfit modifizierter DNA in Gruppen von 3-6 CpGs verifiziert und der Methylierungsstatus der DNA in Promotorbereichen quant. durch Methylierungsprofil-Chips erfasst. Der Methylierungsstatus von G0 und G1 Zellen wird untereinander und mit Parametern, die die B-NHEJ Aktivität beeinflussen verglichen. Der Einfluss von miRNAs der DNMT1 auf die Aktivität von B-NHEJ wird erfasst. Die Auswirkungen von Proteinen der HP1 Familie wird durch Überexpression und Suppression mittels RNA-Interferenz auf die B-NHEJ Aktivität bestimmt. Da Zellen mit Defekten in DNA-PKcs keine Hemmung von B-NHEJ in G0 zeigen, sollen die Wechselwirkungen von DNA-PK auf die Chromatinstruktur analysiert werden.
Hinsichtlich der Exposition gegenüber PM (engl.: particulate matter) werden ultrafeine Partikel aus Verbrennungsprozessen (z.B. Verkehr, Industrie, Hauswärmeerzeugung) als die gesundheitsgefährdendste Partikelfraktion in der Umwelt angesehen; Diese umweltrelevanten ultrafeinen Partikel (UP) werden als bedeutende Umweltquelle exogener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) betrachtet und mit der Induktion von zellulärem oxidativen Stress und Entzündung in Verbindung gebracht. Studien zur Verifizierung der Hypothese, dass eine umweltrelevante Exposition ultrafeiner Umweltpartikel über oxidativen Stress zu genomischer Instabilität von Zielzellen im Respirationstrakt führt, wurden bislang nicht durchgeführt. Aufgabe dieses Projektes ist, die Fähigkeit UP zur Induktion von oxidativem Stress und den damit verbundenen Antworten hinsichtlich der genomischen Integrität in vivo zu bestimmen. Die spezifischen Ziele der Studie sind: - die Fähigkeit inhalierter UP zur Ausbildung von oxidativem Stress in Abhängigkeit Von ihren chemischen Charakteristika zu untersuchen und - die Effekte inhalierter ultrafeiner Partikel auf DNA-Schädigung und -Reparatur zu analysieren. Mit der Studie wird ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die in mögliche gesundheitliche Beeinträchtigungen durch die ultrafeine Komponente von Umweltpartikeln involviert sind, erwartet. Konkret werden die Untersuchungen zu den Effekten auf die DNA-Integrität Hinweise zur Bedeutung von UP aus Verbrennungsprozessen für damit verbundene chronische Erkrankungen (insbesondere Tumoren und Gewebeumbau) erbringen. Die kombinierte vor-Ort-Exposition mit eingehender Partikelcharakterisierung ermöglicht eine detaillierte Verbindung zwischen experimentellen, epidemiologischen und analytischen Daten ultrafeiner Partikel in unserer Umwelt. Schließlich werden unsere Daten auch einen Beitrag leisten zur Entwicklung verbesserter Messstrategien von PM.
Mit Hilfe der klonierten c-DNA fuer ADP-Ribosyltransferase soll der molekulare Defekt in der Reparaturkrankheit Fanconi Anaemie lokalisiert werden. Das Gen fuer ADPRT soll aus verschiedenen Fanconi-Zellinien isoliert und auf eventuelle Fehler analysiert werden. Da der Fehler auch in der Regulation der Expression des Gens liegen kann, muss auch die Promotorstruktur in der Analyse einbezogen werden. Durch Expression der klonierten c-DNA fuer den Ribonuclease-Angiogenin-Inhibitor in E coli oder in Hefe sollen grosse Mengen dieses Proteins fuer strukturelle Untersuchungen produziert werden. Da durch Klonierung und Sequenzierung gezeigt wurde, dass das Ubiquitin-Carrier-Protein E217K des Menschen zu RAD6, einem Reparaturenzym der Hefe analog ist, soll das Ubiquitin-System genauer untersucht werden. Einzelne Reparaturkrankheiten sollen auf Funktion des Ubiquitin-Systems analysiert werden. Die Gene fuer die Bestandteile des Ubiquitin-Systems, Ubiquitin-Carrier (E2) und Ubiquitin aktivierende Enzyme (E1) sollen kloniert und sequenziert werden. Zusaetzlich sollen die Gene fuer RAI und Ubiquitin-Enzyme aus der Maus isoliert werden, um die Voraussetzung fuer homologe Rekombination und reverse Genetik zu schaffen.
Das Ziel des beantragten Projektes besteht in der Prävalidierung des Comet-Assays in den metabolisch kompetenten Vollhautmodellen von MatTek und Henkel. Ferner soll in den Hautmodellen und in humaner Vollhaut die DNA-Reparaturkapazität anhand von Testsubstanzen untersucht werden, die in den Zellen DNA-Addukte bilden oder oxidative Schädigungen verursachen. In verschiedenen Teilaufgaben wird die metabolische Charakterisierung der Hautmodelle vorgenommen. Als Schwerpunkte werden die Metabolitenmuster von drei weiteren Testsubstanzen sowie Aktivitäten und Expressionsmuster bisher nicht untersuchter Enzymfamilien in den Hautmodellen bestimmt und mit der menschlichen Vollhaut verglichen. Weiterhin wird die Prävalidierung des Comet-Assays in den ausgewählten Hautmodellen durchgeführt und die Reparaturkompetenz in den ausgewählten Hautmodellen und humaner Vollhaut soll vergleichend analysiert werden.
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