Atmosphärische Partikel enthalten innerhalb ihrer organischen Fraktion einen bedeutenden Anteil sogenannter 'huminähnlicher' Verbindungen (humic like substances, HULIS). Zur chemischen Zusammensetzung dieser Fraktion ist nur relativ wenig bekannt. Trenntechniken wie Umkehrphasenchromatographie oder Kapillarelektrophorese erlauben keine umfassende Trennung dieser komplex zusammengesetzten Fraktion, weshalb im vorliegenden Projekt die Anwendung einer 2-dimensionalen Trennung nach Polarität (Umkehrphasenchromatographie) und molekularer Größe (Größenausschlusschromatographie) vorgeschlagen wird. Die Kopplung der beiden Dimensionen soll offline geschehen und die erhaltenen Fraktionen gesammelt werden, um davon den Gesamtkohlenstoffgehalt (total organic carbon, TOC), die UV-VIS Absorption, sowie die Elementarzusammensetzung einzelner charakteristischer Substanzen mittels Flugzeitmassenspektrometrie zu bestimmen. Proben von verschieden geprägten Sammelorten (europäischer Hintergrund, asiatische Megacity, ländlich mit starkem Biomasseverbrennungseinfluss) sollen analysiert werden, um anschliessend Muster im zweidimensionalen Raum Polarität vs. Größe finden und vergleichen zu können. Weiterhin sollen die Ergebnisse der offline Charakterisierung mit (außerhalb des Projektes) gewonnenen Daten eines online-Aerosolmassenspektrometers verglichen werden. Die Ergebnisse sollen ein besseres Verständnis zu Konzentration, Zusammensetzung und möglichen Quellen der wichtigen HULIS-Fraktion atmosphärischer Partikel ermöglichen.
Das kontinuierliche Wahrnehmen von Umweltbedingungen und die nachfolgende Adaption sind bei einzelligen Organismen die Voraussetzung zum Überleben. Bei pathogenen Bakterien ist dies gleichzeitig mit der Induktion der Expression von Virulenzgenen verbunden. Eine Vielzahl von Reizleitungssystemen, die für diese Prozesse verantwortlich sind, konnten in den letzten Jahren identifiziert werden. Diese Systeme sind relativ einfach gebaut und bestehen aus einer Sensorkinase und einem Antwortregulator. Die eigentlichen Reize, die durch diese Sensorproteine 'gefühlt' werden, sowie die Mechanismen der Reizaufnahme und Signalweiterleitung sind allerdings für die meisten Systeme bisher unbekannt. Ich möchte in diesem Projekt am Beispiel der Sensorkinasen EnvZ (Osmosensor), CpxA (Wahrnehmung von Streß auf die bakterielle Zellhülle, pH) und des Sensors und Transkriptionsaktivators CadC (pH-Sensor) aus Escherichia coli die Natur des Reizes sowie die molekularen Mechanismen der Reizaufnahme untersuchen. Die Osmolarität hat auch einen bedeutenden Einfluss auf die Regulation der Expression der Virulenzgene bei verschiedenen pathogenen Bakterien. Ziel der Untersuchungen ist es, die Sensorkinase EnvZ (Osmosensor) aus Shigella flexneri erstmalig biochemisch zu charakterisieren. Weiterhin soll mittels 2D-Elektrophorese nach weiteren Proteinen in S.flexneri gesucht werden, die in Abhängigkeit von Veränderungen der Osmolarität phosphoryliert werden.
An ausgewaehlten Gruppen von europaeischen Farnpflanzen wird mit Hilfe der Isoenzym-Gelelektrophorese die genetische Struktur von Populationen untersucht.
In einer Zusammenarbeit der Physikalischen und Theoretischen Chemie und der Analytischen Chemie der BUW ist es 2005 gelungen, neben den etablierten Atmosphärendruck-Ionisationsverfahren ESI, APCI und APPI eine vierte AP Methode einzuführen, die auf der Laserionisation basiert (Atmospheric Pressure Laser Ionization, APLI). Das Verfahren hat ein sehr großes Potential im Bereich der Ultra-Spurenanalytik in der Gas- und Flüssigphase und findet zurzeit international größere Beachtung. Mit Hilfe der APLI werden völlig neue Ansätze in der Atmosphärendruck-Massenspektrometrie möglich. Diese sollen in den kommenden Jahren mit Nachdruck verfolgt werden. Die APLI Methode verbindet die Massenspektrometrie sowohl mit den chromatographischen Methoden HPLC, CE, als auch GC. Darüber hinaus kann sie direkt an Reaktoren gekoppelt werden, die bei Atmosphärendruck operieren und ist damit optimal für den Einsatz in atmosphärisch-chemischen Untersuchungen geeignet.
Jaehrlich fallen bei der Gefluegelzucht mehr als 20.000 t Federn an. Federn bestehen zu 95 Prozent aus dem unloeslichen Strukturprotein Keratin, welches sehr stabil ist. Durch chemische und mechanische Methoden koennen Federn hydrolysiert werden und als Quelle fuer definierte Aminosaeuren und Peptide genutzt werden. Problematisch ist die dabei anfallende hohe Salzfracht. Der Einsatz von Enzymen kann eine 'sanfte' Aufarbeitung der Federn bewirken. Von Vorteil ist dabei die Entstehung definierter Produkte. Aus heissen Quellen der Azoreninsel San Miguel wurde ein anaerober, thermophiler Stamm mit keratinolytischer Aktivitaet isoliert und als Fervidobacterium pennavorans charakterisiert. Federn, Wolle und Keratin aus Hoernern konnten von dem Neuisolat abgebaut werden. Zellgebundene Keratinaseaktivitaet konnte im pH-Bereich von 6-11 und im Temperaturbereich von 30-120 Grad C. nachgewiesen werden. Das Enzym wurde mit Hilfe von praeparativer Gelelektrophorese gereinigt und naeher charakterisiert. Es handelte sich um eine Serinprotease mit einer Molekularmasse von 130.000 Da, die optimal bei pH 10,0 und 80 Grad C. aktiv war. Der isoelektrische Punkt lag bei pH 3,8. Die thermostabile Keratinase konnte das Modellsubstrat Federmehl zu Peptiden mit einer Molekularmasse kleiner 3.000 Da abbauen. Die Keratinase soll zur Umsetzung von unloeslichen und loeslichen Proteinen wie Keratinen oder Gelatine in industriell verwertbare Produkte eingesetzt werden.
Mais und Milch sind Lebensmittel, die bei der afrikanischen Bevölkerung sehr beliebt sind und stark konsumiert werden. Unglücklicherweise sind sowohl Grundnahrungsmittel als auch Futtermittel und Milch häufig und stark mit Aflatoxinen kontaminiert, wodurch die Bevölkerung ständig Toxingehalten ausgesetzt ist, die weit über den empfohlenen Grenzwerten liegen. Dennoch nimmt der Konsum dieser Produkte beständig zu. AflaZ fokussiert daher auf eine Verbesserung der Lebensmittelsicherheit und des Qualitätsstandards von Milch, Mais und daraus hergestellten Produkten; Kenia dient als Modellregion, da es ein Hochrisikogebiet für Aflatoxinkontaminationen und Schimmelpilzbefall im Lebensmittelbereich ist. Im Rahmen des AflaZ-Projektes sollen schnelle, effektive und nachhaltige Methoden entwickelt werden, um Pilzbefall und Aflatoxinkontamination sowohl auf dem Feld als auch im Lager sensitiv zu detektieren, zu analysieren und effektiv zu reduzieren. Ein nachhaltiger und effektiver Wissenstransfer zwischen Wissenschaftlern und Anwendern ist dabei die Voraussetzung für gewünschte Verhaltensänderungen in Haus und Hof. Aufgrund dessen implementiert AflaZ umfangreiche Programme zur Kompetenzerweiterung (Capacity Building), die Kooperationen mit lokalen Institutionen, Farmern, Studierenden und weiteren Beteiligten mit einschließen und ermöglichen so einen nachhaltigen Wissenstransfer, kulturelle Akzeptanz der Empfehlungen und die effektive Integration der neuen Methoden durch die lokale Bevölkerung. Am FLI soll dabei anhand eines Carry-over Versuches mit Milchkühen die gesamte Lebensmittelkette, beginnend mit der Fütterung von Aflatoxin kontaminiertem Mais, bis hin zum fertigen Milchprodukt modellhaft abgebildet werden. Für die Diagnostik des Gesundheitsstatus der Milchkuh während des Fütterungsversuches werden insbesondere Blutproben herangezogen. Dabei wird ein Panel an klinisch-chemischen sowie hämatologischen Parametern bestimmt, welche es erlauben, neben den hepatotoxischen Effekten auch mögliche Wirkungen auf den Energie-, Fett- und Proteinstoffwechsel sowie auf das differenzierte rote und weiße Blutbild zu erfassen. Zusätzlich sollen einzelne Lymphozytensubpopulationen (T- und B-Zellen) näher charakterisiert werden. Das in der Leber gebildete, hochreaktive Aflatoxinepoxid kann unter Addukt- Bildung die DNA schädigen. Diese DNA-Schädigungen können im Blut mit Hilfe des auf Gelelektrophorese beruhenden Comet-Assays nachgewiesen werden. Die Analyse von Biomarkern spielt für die Bewertung der Exposition eine wichtige Rolle und kann Aussagen über die Verteilung im Körper, die Metabolisierung und Ausscheidung liefern, um eine Risikoabschätzung vornehmen zu können. Bei der Milchkuh wird hier vor allem der Hauptmetabolit Aflatoxin M1 in der Milch herangezogen. Durch die Analyse weiterer Biomarker in Blut und Urin sollen Endpunkte einer Risikobewertung identifiziert werden. Hierzu sollen geeignete chromatographische oder immunologische Methoden etabliert werden.
Das Hauptziel des Teilvorhabens, Peroxidasen aus Pilzen, die entweder aus Submers Kulturen von Basisdiomyceten selbst isoliert oder von den Partnern ASA und AB Enzymes (assoziierter Partner) zur Verfügung gestellt werden, nach der Immobilisierung an geeigneten Trägertextilien bzgl. ihrer Enzymaktivitäten zu untersuchen. Zur biochemischen Charakterisierung der immobilisierten Peroxidasen (Km, kcat) dienen dabei neben allgemeinen Peroxidase-Modellsubstraten wie ABTS insbesondere Bixin und beta-Carotin. Ein besonderes Augenmerk liegt daneben auf der Bereitstellung des erforderlichen Cofaktors H2O2 in geeigneter Konzentration. Darüber hinaus werden die immobilisierten Peroxidasen im wiederholten oder dauerhaften Einsatz zur Bleichung von Molke erprobt. Die Bleichung der Molke wird mittels CIELab-System quantitativ erfasst. Zur biochemischen Charakterisierung der freien und textil-geträgerten Peroxidasen dienen photometrische und elektrophoretische Untersuchungen. Wichtige Parameter sind die Erfassung der (Rest)aktivität der Peroxidasen nach der Immobilisierung, die Detektion eines eventuellen Übergangs des Enzyms in die Lebensmittelmatrix Molke, sowie die Einstellung einer optimalen Konzentration des Cofaktors H2O2.
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