Die Fähigkeit, Chitin abzubauen, ist für das Überleben und den Besiedelungserfolg von pilzlichen und bakteriellen Pathogenen, von denen viele agronomisch wichtige Krankheiten verursachen, wesentlich. Bei pathogenen Bakterien, denen Chitin fehlt, spielt der Abbau von Chitin eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Pilzen, die Pflanzen besiedeln, und beim Überleben in Insekten, wenn die Übertragung über Vektoren erfolgt. Xylella fastidiosa ist als prioritärer Schädling in Europa gelistet. Dieses von Insekten übertragene Bakterium verursacht das OLIVE QUICK DECLINE SYNDROME (OQDS) und Krankheitsausbrüche in den letzten zehn Jahren. Die Dringlichkeit, ein Verständnis dafür zu entwickeln, wie X. fastidiosa seine Wirte kolonisiert, wird durch den Mangel an Behandlungsmitteln deutlich. Es wurde beschrieben, dass eine Chitinase, chiA, von X. fastidiosa sekretiert wird und i) die Verwendung von Chitin als Kohlenstoffquelle vermittelt, möglicherweise in Insektenvektoren und von Xylem-besiedelnden Pilzen, ii) die Übertragung durch Insektenvektoren fördert und iii) für eine systemische Infektion in Pflanzen erforderlich ist, möglicherweise gegen pflanzenbesiedelnde Pilze wirkend. Unser Fokus liegt auf chiA, weil diese bakterielle Chitinase iv) eine ungewöhnliche Schleife in ihrer modellierten 3D-Struktur trägt, die die Substratspezifität bestimmen könnte, und v) wahrscheinlich Chitin-Oligomere freisetzt, die Immunantworten in Wirten von X. fastidiosa modulieren könnten. Obwohl Chitinasen seit Jahrzehnten untersucht werden, haben wir wenig Wissen über die Beziehungen zwischen Substrat, Struktur, Produkt und deren Bioaktivität, die für das Verständnis ihrer Rolle als Virulenzfaktoren von entscheidender Bedeutung sind. Hier ist unser Ziel, zwei Schlüsselfragen zu beantworten: 1. Wie baut X. fastidiosa Chitin ab? Die Analyse der chiA Aktivität und Spezifität unter Verwendung einer Reihe definierter Chitinsubstrate und verschiedener Organismenquellen wird Abbauprodukte aufdecken, die dann einer Bioaktivitätsanalyse unterzogen werden. Struktur-Funktions-Beziehungen werden in silico, in vitro und in vivo untersucht. 2. Welches immunmodulatorische Potenzial haben Chitin-Oligomere, die von X. fastidiosa produziert werden? Der Vergleich verschiedener Immunantworten auf chiA Produkte in Modell- und Wirtspflanzen sowie die Untersuchung der Mustererkennungsrezeptor-vermittelten Immunität dürften Erkenntnisse zu dieser Frage liefern. Als wichtiger Virulenzfaktor ist es unser übergeordnetes Ziel, die molekularen Details der chiA Funktion besser zu verstehen und ihre Rolle bei der systemischen Pflanzeninfektion aufzuklären. Wir stellen uns vor, dass dieses Wissen für biotechnologische Zwecke nützlich sein könnte.
Dieses Projekt befasst sich mit Erkrankungen der Leitgefäße von Nutzpflanzen durch Xylella fastidiosa (Xf), einem komplexen Problem in der Landwirtschaft, und wird den Prozess der bakteriellen Vesikelbildung bei Wirtsinteraktionen aufklären. Wir nehmen an, dass Xf wegen eines fehlenden Typ III Systems extrazelluläre Vesikel (EVs) verwendet, um immunmodulatorische Effektoren, einschließlich extrazellulärer (ex)RNAs, zu sekretieren. Dies wird durch Erkenntnisse der 1. Förderperiode gestützt, die zeigen, dass kleine (s)RNAs, messenger (m)RNAs und RNA-bindende Proteine (RBPs) z.B. tRNA-Ligasen und Hfq mit Xf-EVs assoziiert sind. Angesichts der Tatsache, dass Hfq an bakterieller RNA Interferenz (RNAi) beteiligt ist, streben wir in der 2. Förderperiode an, ein Verständnis i) der RNA-EV-Beladung zu erlangen, einschließlich der phänotypischen Charakterisierung von ?hfq-Mutanten und der Identifizierung von Hfq-gebundenen RNAs und Komplexen. Dies wird in Zusammenarbeit mit C1 Goesmann und B2 Kehr möglich sein. Ermutigt durch unsere ersten Beobachtungen der dsRNA-vermittelten antibakteriellen Gen-Silencing werden wir unsere Strategien zur sprühinduzierten Gen- Silencing (SIGS) und Wirt-induzierten Gen-Silencing (HIGS) verbessern, indem wir RNAs entwickeln, die mit Hfq (mit A6 Šecic) kompatibel sind. ii) In Zusammenarbeit mit A4 Weiberg werden wir infektionsrelevante evRNAs evaluieren und ihre vorhergesagten pflanzlichen Zielgene untersuchen, indem wir entsprechende genetische Mutanten und Reporter-Linien, die evRNAs binden, phänotypisieren. iii) Angesichts der wahrscheinlichen genetischen Redundanzen innerhalb der Argonaut (AGO)-Genfamilie und des durch B5 Meister verfügbaren Verfahrens werden wir uns mit der Rolle von AGO beim Wirtsgen-Targeting durch Xf-sRNAs in Arabidopsis thaliana und, wenn es die Zeit erlaubt, in Oliven befassen. Dies wird zu den AGO-Forschungsaktivitäten mehrerer Gruppen und vergleichenden Studien innerhalb der RU5116 beitragen. Mit B5 Meister werden wir auch einen „Anchor-away“-Ansatz erforschen, bei dem TNRC6-ähnliche Peptide transgen exprimiert werden. iv) Um einen RNA-Transfer zwischen Bakterien und Pflanzen zu untersuchen, werden wir mit A4 Weiberg und B3 Feldbrügge zusammenarbeiten und modernste Reportersysteme einsetzen. Unser Ziel ist es, eine Rolle bakterieller evRNAs während der Infektion zu ermitteln, die, wenn sie verstanden wird, zur Entwicklung von RNA-basierten Strategien gegen Xf und gentechnisch veränderte Pflanzen, die gegen evRNAs von Xf resistent sind, genutzt werden könnte.