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Novel assessment methods in ecotoxicology for the identification of hormonal active substances: Combining the fish sexual development test with gene expression endpoints

For the evaluation of effects of hormone-active substances to fish, several test guidelines have been validated by the OECD which are included in the Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disruptors (OECD, 2010). In these tests, the assessment of physiological parameters is limited to the established biomarkers like vitellogenin or 11-keto testosterone in blood plasma or liver tissue. A promising approach<BR>to refine existing testing strategies is the integration of molecular endpoints, which rapidly respond to exposure. Furthermore, these endpoints can be indicative of potential adverse effects at the organismal level by providing information, which connect to the initiating effect of a substance. This is in line with the concept of Adverse Outcome Pathways (AOP), which evolved from the "toxicity pathwayŁ approach as a mechanistic evaluation tool for the risk assessment.<BR>Quelle: https://www.umweltbundesamt.de/

GO-Bio 2: AGRO-PROTECT: Weiterentwicklung einer Antikörper-vermittelten Resistenz Plattform

Das Projekt "GO-Bio 2: AGRO-PROTECT: Weiterentwicklung einer Antikörper-vermittelten Resistenz Plattform" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie durchgeführt. Die Weltbevölkerung wird nach Schätzungen der Bevölkerungsabteilung der Vereinigten Nationen noch bis 2025 auf über 8 Milliarden steigen. Gleichzeitig soll es zu einer Reduktion der Agrarfläche um bis zu 30 Prozent kommen. Es wird bis dahin nicht wie im Moment ein Verteilungsproblem, sondern ein Mangel an Nahrungsmitteln vorliegen. Neue Agrarfläche wird nur sehr begrenzt erschlossen werden können und ist zumeist ökologisch z.B. durch Brandrodung von Urwaldgebieten nicht vertretbar. Eine Lösung bietet die Grüne Biotechnologie. Insbesondere durch Generierung von Trocken-, Salz- und Pathogenresistenten Nutzpflanzen. Wir haben eine innovative, patentierte Plattform entwickelt, mit deren Hilfe man Pflanzen unempfindlich gegen Schadpilze machen kann, um einen Beitrag zur Lösung solcher Probleme zu leisten. Die Plattform umfasst die Entwicklung von Antikörper vermittelten Pathogen resistenten Nutz- und Zierpflanzen. Dabei werden antifugale Peptide/Proteine mit Antikörperfragmenten fusioniert und in der Zielpflanze exprimiert, was zu einer Resistenz der Nutzung gegen das Pathogen führt. Diese Serviceleistung soll durch die neu zu gründende Agro-Protect GmbH Saatgut Unternehmen, wie Monsanto, Syngenta, DSV, Bayer und BASF angeboten werden. In der Phase I dieses Antrages soll ein Prototyp (Phytophthora infestans resistente Kartoffelpflanze) entwickelt werden, um diesen dann den oben aufgeführten Firmen zum Kauf bzw. in Lizenz (Sortenschutz) anzubieten (Phase II). Die erwarteten Einnahmen sollen zur Finanzierung der Entwicklung weiterer pathogen resistenter Pflanzen und damit zur Schaffung neuer innovativer, zukunftssicherer Arbeitsplätze in Deutschland verwendet werden. Die Produktion des Saatguts und der Vertrieb an den Landwirt soll in der Anfangsphase durch bestehende Netzwerke der Saatgut Firmen weltweit übernommen werden. Das Geschäftsmodel verschafft allen Beteiligten der Wertschöpfungskette und dem Endverbraucher Vorteile. Saatguthersteller können mit geringerer Resistenzbildung rechnen. Dem Landwirt werden höhere Ertragssicherheit, günstigere Produktionskosten und geringere Resistenzbildung garantiert. Und der Endverbraucher kann mit geringeren Kontaminationen von Spritzmitteln und Mykotoxinen rechnen.

Amphibien als Modell zum Nachweis endokrin wirksamer Stoffe (endocrine disruptors) mit Wirkungen auf die Reproduktionsbiologie

Das Projekt "Amphibien als Modell zum Nachweis endokrin wirksamer Stoffe (endocrine disruptors) mit Wirkungen auf die Reproduktionsbiologie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forschungsverbund Berlin, Leibniz-Institut für Gewässerökologie und Binnenfischerei durchgeführt. Umweltrelevante Stoffe können mit den endokrinen Systemen von Tier und Mensch interagieren. Diese endokrin wirksamen Substanzen, auch 'endocrine disruptors (ED) genannt, beeinflussen hauptsächlich die Reproduktionsbiologie und das Schilddrüsensystem. Die klassischen Tiermodelle für diese endokrinen Systeme finden sich bei den Amphibien, die deshalb auch als sensitive Versuchsmodelle für den Nachweis der verschiedenen Wirkmechanismen (MOA) der ED dienen können. Amphibien werden gegenwärtig hinsichtlich ihrer Eignung, sowohl (anti)estrogene wie auch (anti)androgene MOA auf die Reproduktionsbiologie zu detektieren, geprüft. Die Reproduktionsbiologie kann auf verschiedenen endokrinen Ebenen gestört werden, wobei Einflüsse auf negative Feed-back-Mechanismen und die Konzentrationen der Sexsteroide, Androgene und Estrogene, zu Änderungen in der Genexpression spezifischer Biomarker führen. Zur Bestimmung aller 4 prinzipiell möglichen MOA der ED auf die Reproduktionsbiologie wurden adulte Xenopus laevis beiderlei Geschlechts in vivo exponiert mit dem Estrogen Ethinylestradiol (EE2), dem Antiestrogen Tamoxifen (TAM), dem Androgen Methyldihydrotestosteron (MDHT) und dem Antiandrogen Flutamide (FLU). Die Exposition mit diesen ED erfolgte bei einer Konzentration von 10-8 M über 4 Wochen und parallel dazu mit Wasser des anthropogen belasteten Flusses Lambro (Italien). Die Feed-back- Mechanismen der die Reproduktion regulierenden Hypothalamus- Hypophysen-Achse wurde untersucht anhand der Änderungen der Genexpression des Gonadotropin releasing Hormons (GnRH), des luteinisierenden Hormons (LH beta) und des Follikel stimulierenden Hormons (FSHß) im Gehirn und der Hypophyse mittels semi-quantitativer RT-PCR. Die Expression von LHß war in Männchen höher als in Weibchen, während für FSH beta und GnRH keine geschlechtsspezifischen Unterschiede festzustellen waren. EE2 and MDHT verminderten die LH alpha-mRNAExpression im Gehirn männlicher X. laevis, während in Weibchen nur EE2 die LH alpha-mRNA reduzierte. TAM steigerte LH alpha-mRNA und FSH alpha-mRNA in weiblichen X. laevis, während keinerlei andere Behandlung die FSH alpha- mRNA-Expression veränderte. Die GnRH-Expression wurde nicht beeinflußt und die Exposition mit Wasser des Lambro zeigte keinerlei signifikanten Effekt.

Kontrolle des Blühzeitpunktes durch Trehalose-6-Phosphat

Das Projekt "Kontrolle des Blühzeitpunktes durch Trehalose-6-Phosphat" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie durchgeführt. Im Lebenszyklus einer Pflanze ist die Blühinduktion von zentraler Bedeutung. Gerade wegen seiner Wichtigkeit steht das Blühen unter der Kontrolle eines komplexen genetischen Netzwerkes, das endogene Signale (Hormone, Kohlenhydrate, Alter) und Umweltsignale (Temperatur, Tageslänge) miteinschließt. Unter induktiven Tageslängen wird das Schlüsselgen der Blühinduktion FLOWERING LOCUS T (FT) in der Vaskulatur der Blättern induziert und löst als Langstreckensignal im Apikalmeristem die Blütenbildung aus. Vom Dissacharid Trehalose-6-Phosphat konnte gezeigt werden, dass es in der Koordination von Kohlenhydratstatus und Entwicklungsprozessen als Signalmolekül fungiert. Arabidopsis thaliana Pflanzen, denen das TREHALOSE 6-PHOSPHAT SYNTHASE1 (TPS1) Gen fehlt, blühen außerordentlich spät. Kürzlich konnten wir zeigen, dass der TPS1/T6P-Signalweg die Expression verschiedener Blühzeitpunkt-regulierender Gene kontrolliert. In der Vaskulatur des Blattes ist das T6P/TPS1 Signal zur Induktion von FT unabdingbar, wohingegen im Sproßapikalmeristem MIR156 und dessen Zieltranskripte der SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE (SPL)-Gene das Ziel des T6P/TPS1 Signals darstellen. Gemeinsam stellen die umweltabhängigen (photoperiodischen) und physiologischen (T6P/TPS1) Signale sicher, dass das Blühen nur unter optimalen Bedingungen eingeleitet wird, das heißt wenn die Tageslänge eine Mindestlänge überschreitet und der Kohlenhydrathaushalt die energieaufwändige Blühinduktion und die Produktion von Samen gewährleisten kann. Dennoch bleiben viele Fragen die Funktion des T6P/TPS1 Signals betreffend offen. In diesem Antrag schlagen wir eine Serie von Experimenten vor, mit dem Ziel das T6P/TPS1 Signal besser in die Signalwege der Blühzeitpunktregulation einzubinden. Aus unseren Vorarbeiten ergibt sich, dass der T6P/TPS1-Signalweg das Blühen teilweise durch die Zellzyklus-abhängige Modulation der Stammzellanzahl im Meristem reguliert - ein zuvor unerforschter Aspekt, den wir weiter untersuchen werden. Außerdem konnte wir zeigen, dass T6P/TPS1 die Fähigkeit von Pflanzen auf Änderungen der Umgebungstemperatur zu reagieren, ebenso beeinflusst wie die Reaktion auf längere Kälteperioden (Vernalisation). Darauf aufbauend werden wir die Interaktion des T6P/TPS1-Signalweges mit der Temperatur-abhängigen Regulation des Blühens untersuchen. Abgesehen von den oben erwähnten Experimenten, die sich auf bekannte Gene und Signalwege fokussieren, werden neue Komponenten des T6P/TPS1-Signalweges identifiziert werden. Zu diesem Zweck haben wir bereits eine umfassende genetische Sichtung durchgeführt, um Suppressoren des späten Blühens der tps1-Mutante zu identifizieren. Als Teil des Schwerpunktprogramms werden wir die zugrundeliegenden Gene identifizieren, diese umfassend charakterisieren und in den T6P/TPS1-Signalweg integrieren. Zusammenfassend werden die geplanten Experimente wertvolle Hinweise zur Integration des Kohlenhydrathaushalts der Pflanzen in die Signalwege der Blühinduktion liefern.

Teilprojekt B

Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Halle-Wittenberg, Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Professur für Pflanzenzüchtung durchgeführt. Drought stress during grain filling can result in reduced grain filland subsequent loss in grain yield. As part of GABI-GRAIN, this projectaims to identify novel exotic proteins associated with improved droughttolerance during grain filling in barley. To achieve this aim a set ofspring barley introgression lines (S42-ILs) that originate from thecross Scarlett (H. vulgare) x ISR42-8 (H. spontaneum) (Schmalenbach etal. 2008 ) were screened for drought tolerance during grain filling. Intotal 49 S42-ILs and Scarlett as the control genotype were grown in theglasshouse using an automated irrigation system. At 10 days postanthesis (DPA) the irrigation system was set to provide well-wateredand drought stress conditions. Plants were scored for physiologicaltraits including flowering time, grain maturity, biomass, number ofears, grains per ear, thousand grain weight, grain yield and harvestindex. This phenotype data was then used for line by trait associationstudies to identify quantitative trait loci (QTL). This analysisidentified exotic alleles associated with increased and also decreasedplant performance under drought stress. Furthermore, we could alsoconfirm several QTL detected in previous field experiments using thisS42-IL population. To understand the molecular mechanism controllingidentified QTL a proteomics study is underway. From selected droughttolerant S42-ILs and Scarlett that have been grown under well-wateredand drought stress conditions proteins will be extracted from grainsamples collected at 12, 16, 20 and 24 DPA. Differentially expressedproteins will then be detected using quantitative 2D gelelectrophoresis. Identified proteins associated with improved droughttolerance can then potentially be used as diagnostic bio-markers toassist in the selection of higher yielding barley lines under droughtconditions. Furthermore, this research will give a greaterunderstanding of the genetic and biochemical mechanisms that controldrought tolerance in barley.

Teil I

Das Projekt "Teil I" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Justus-Liebig-Universität Gießen, Institut für Phytopathologie durchgeführt. Ziel des Vorhabens ist, den Einfluss des Bodentyps, von organischem Dünger sowie der Einarbeitung von belasteten Pflanzenresten in den Boden für die Aufnahme und Verteilung von Salmonella enterica und enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in die Nutzpflanzen aufzuklären. Die Ziele des Vorhabens sind in drei Gruppen unterteilt: i) Etablierung von Methoden für den spezifischen Nachweis von Salmonella und EHEC in pflanzlichen Geweben und im Boden; ii) Untersuchung von Faktoren die den Umfang der Besiedlung von Nutzpflanzen mit Humanpathogenen beeinflussen. Aufgrund der bestehenden Gefährdung für den Verbraucher wird die Besiedelung von Kopfsalat und Feldsalat untersucht; und iii) Risikoeinschätzung für den Verbraucher. In dem Teilvorhaben soll der Einfluss von Anbaubedingungen auf die Reaktion von Kopf- und Feldsalat auf Infektionen mit EHEC und Salmonella untersucht werden. Darüber hinaus wird die Verteilung der Bakterien in der Pflanze untersucht und eine Einschätzung der Gesundheitsgefährdung der Konsumenten gemacht. In zwei Schritten wird ermittelt, wie Kopfsalat und Feldsalat, die in verschiedenen Böden/Dünger Kombinationen gewachsen, auf die Infektion durch EHEC und S. Typhimurium reagieren. Zunächst wird die Expression ausgewählter Gene ermittelt, danach die globale Änderung der Genexpression. Nachfolgend wird die Effizienz der Abwehrmechanismen untersucht. Die Verteilung der Bakterien in Kopf- und Feldsalat wird mit Hilfe von Wildtypstämmen, die gfp oder dsRed Gene exprimieren und konfokaler Mikroskopie ermittelt. Für die Basis der Einschätzung der Gesundheitsgefährdung der Konsumenten wird die quantifizierte Anzahl der Bakterien in Pflanzengewebe, die bekannte Infektionsdosis von Salmonella und EHEC, sowie die bereits bekannte Virulenz von Salmonella aus pflanzlichem Gewebe dienen.

Teilprojekt 1 und 7

Das Projekt "Teilprojekt 1 und 7" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forstliche Versuchs- und Forschungsanstalt Baden-Württemberg durchgeführt. Das Verbundprojekt zielt auf die Entwicklung nachhaltiger, waldhygienischer Konzepte am Beispiel ausgewählter Vergleichsregionen in Deutschland, für die eine hohe Vulnerabilität durch die Effekte des Klimawandels, die Globalisierung sowie durch die Bildung bzw. Ausweitung von Ballungszentren besteht oder für die Zukunft erwartet wird. Das Untersuchungsgebiet erstreckt sich entlang eines diagonal durch ganz Deutschland von Südwesten nach Nordosten reichenden Transektes, der vergleichbar sensible Standorte mit limitierter Wasserverfügbarkeit und erhöhtem Wärmeangebot verbindet und daher exemplarisch für eine Übertragbarkeit auf zukünftige Entwicklungen geeignet erscheint. Schwerpunkte des Vorhabens stellen standortadaptierte Baumarten (Eichen und Kiefern) dar, die sich durch eine große ökologische Amplitude auszeichnen und somit auch für die zukünftige Waldwirtschaft von Bedeutung sind. Die Untersuchungen zielen auf die Förderung der natürlichen Baumwiderstandskraft, die Anpassung und Optimierung von Diagnose-, Monitoring- und Prognoseverfahren sowie insgesamt auf einen zukunftsorientierten Waldschutz mit breiter gesellschaftlicher Akzeptanz. Die verschiedenen, entlang des Transektes zu erwartenden Eichen- und Kiefern-Herkünfte werden bezüglich ihrer Abwehrreaktionen auf Engerlingfraß (Eiche - TP1) bzw. Infektion mit Mistel und Sphaeropsis (Kiefer - TP7) charakterisiert. Über Expressionsmuster sollen Kandidatengene identifiziert werden, die an spezifischen Abwehrreaktionen beteiligt sind. Die Daten werden sowohl aus einem kontrollierten Gewächshausversuch, als auch durch die Beprobung von ausgewählten Versuchsflächen gewonnen. Die Baumpopulation dieser Versuchsflächen muss dafür zusätzlich herkunftsgenetisch untersucht werden.

Teilprojekt B

Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universitätsklinikum Essen (AöR), Institut für Medizinische Strahlenbiologie durchgeführt. Das Gesamtziel des vorliegenden Vorhabens, das in drei Arbeitspaketen (WP) aufgegliedert ist, ist es, den Beitrag der Komplexität eines durch ionisierende Strahlung induzierten DNA Doppelstrangbruches (DSBs) auf die Auswahl des Reparaturweges, die Erzeugung von Verarbeitungsfehlern, wie auch auf die Aktivierung von Checkpoints im Zellzyklus zu untersuchen. Speziell, wird die Hypothese geprüft, dass DSB-Cluster eine höchst gefährliche Form der DNA-Schädigung darstellen, mit einem besonders hohen Risiko für misrepair, die schließlich zum Zelltod oder genomische Instabilität führt. Weitere Stufen der DSB-Komplexität werden durch kombinierte Behandlung mit ionisierender Strahlung und Cisplatin erreicht. Cisplatin ist eines der erfolgreichsten Chemotherapeutika in der Krebstherapie, das oft mit Bestrahlung kombiniert wird. Cisplatinresistenz stellt ein zentrales Problem in der klinischen Anwendung dar und wird von Faktoren beeinflusst, die hier untersucht werden. WP3: Prof. Iliakis 1. Konstrukt Aufbau zur Untersuchung der Auswirkungen der DSB-Cluster-Komplexität in Bezug auf DSB-Zahl und Entfernung, wie auch auf die Wahrscheinlichkeit für misrepair. 2. Chromosomenaberration und Zellüberleben werden untersucht, und Genomveränderungen durch Next Generation Sequencing (NGS) analysiert. WP4: Prof. Iliakis 1. Zelllinien mit regulierbaren I-SceI Expression werden erzeugt um Zellüberleben und Chromosomenaberrationen zu messen. 2. NGS wird eingesetzt um fehlerhafte Verarbeitung von DSB und DSB-Cluster genauer zu analysieren, und Genexpressionsmuster untersucht. WP5: Prof. Stuschke 1. Wechselwirkungen von Cisplatin und IR in der G1-, S- und G2-Phase des Zellzyklus, wie auch der Einsatz von NHEJ und HRR werden untersucht. Letzteres auch durch den Einsatz I-SceI-induzierten DSB in speziell integrierten Konstrukten 2. Die Wirkung von Cisplatin und IR auf DSB-Resektion, Checkpoint Aktivierung und Chromatinstruktur werden nach einzeln und fraktionierter Bestrahlung untersucht.

Teilprojekt Uni Ulm

Das Projekt "Teilprojekt Uni Ulm" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Ulm, Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie durchgeführt. Die globale Erderwärmung und die Versorgung mit Treibstoffen und Basischemikalien aus fossilen Quellen erfordern die Entwicklung alternativer, nachhaltiger Synthesewege für solche Substanzen. Biotechnologische Verfahren bieten eine Lösung, allerdings nur mit Substanzen, die nicht mit der menschlichen Ernährung konkurrieren. Neben Lignocellulose kommen dafür nur Gase wie CO2 oder CO in Frage. Hier soll CO2 mit Hilfe rekombinanter autotropher acetogener Bakterien in die industriell wichtige Plattformchemikalie 3-Hydroxypropanoat umgewandelt werden. Das ermöglicht eine kostengünstige Herstellung dieser Substanz, für die es keine ökonomisch tragfähige Synthese aus Rohölprodukten gibt, und die Reduktion eines bedeutenden Treibhausgases. Das Gen für Pyruvat-Synthase aus Acetobacterium woodii wird durch PCR amplifiziert und in einen geeigneten Schaukelvektor subkloniert (pJIR750). Zur Expression wird der Promoter des Acetat-Kinase-Gens aus A. woodii verwendet. Dann wird das Gen für Lactat-Dehydrogenase amplifiziert und subkloniert. Als Wirt für dieses Gen dient z.B. Clostridium acetobutylicum. Das dritte Gen kodiert eine Coenzym A-Transferase (Katalyse der Reaktionen: Lactat in Lactyl-CoA und 3-Hydroxypropanoyl-CoA in 3-Hydroxypropanoat). Als Wirt dient Megasphaera elsdenii. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Das vierte Gen kodiert eine Lactyl-CoA-Hydratase (Katalyse der Reaktion: Lactyl-CoA in Acrylyl-CoA). Als Wirt dient M. elsdenii. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Das fünfte Gen kodiert eine Acrylyl-CoA-Hydratase (Katalyse der Reaktion: Acrylyl-CoA in 3-Hydroxypropanoyl-CoA). Als Wirt dient Chloroflexus aurantiacus. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Analoge Gene werden auch aus C. propionicum, C. homopropionicum und C. neopropionicum kloniert und analysiert, um möglicherweise Patente zu generieren. Zum Schluss erfolgen Optimierung von Operon-Struktur und -Expression sowie Produktionstest in Laborkulturen und Kleinfermentern.

Teilprojekt: IME-MB

Das Projekt "Teilprojekt: IME-MB" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie durchgeführt. Ziel des Vorhabens ist die Etablierung von Nutzpflanzen mit erhöhter Produktivität bei reduzierter Nutzung von Ressourcen wie Wasser und Dünger und verbesserter Resistenz gegen abiotischen Stress. Hierdurch soll der steigende Bedarf an landwirtschaftlicher Produktion verursacht durch das globale Bevölkerungswachstum und die Nutzung von Biomasse zur Energieproduktion befriedigt werden. Die Photorespiration der wichtigen Nutzpflanzen Raps und Reis soll durch Überexpression einer Glycolatdehydrogenase in den Chloroplasten reduziert werden. Der transgene Ansatz soll durch Nutzung alternativer Konstrukte optimiert werden. Dazu werden initial transgene Arabidopsis Linien umfassend charakterisiert. Am Ende der Förderperiode soll Saatgut für erste Feldtests zur Verfügung stehen. Die erzielten Ergebnisse werden eine fundierte Voraussage über das ökonomische Potenzial der eingesetzten Technik ermöglichen. Ein optimierter Ansatz soll im direkten Anschluss in mehreren Nutzpflanzen verwirklicht werden. Die entwickelten Technologien können zur Analyse weiterer wissenschaftlicher Fragestellungen genutzt werden.

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