s/in-vitro-test/in vitro-Test/gi
Epidemiologische Untersuchungen belegen einen Zusammenhang zwischen Luftschadstoffbelastung und entzündlichen Erkrankungen der Atemwege. Einen besonderen Stellenwert hat in diesem Zusammenhang die Lösungsmittel- und Aldehyd-induzierte Rhinitis. Eigene Vorarbeiten haben gezeigt, dass auch niedrige Schadstoffdosen subklinische Schleimhautentzündungen verursachen können. Im Rahmen des Projektes werden mit Hilfe eines von unserer Arbeitsgruppe entwickelten in vitro Models Expositionen gegenüber arbeitsmedizinisch relevanten Schadgasen durchgeführt und die Synthese und Freisetzung von entzündungsrelevanten Zytokinen mittels ELISA-assays und quantitativer mRNA-Analytik untersucht. Wir konnten die Hochregulation verschiedener Zytokine nach Exposition mit hohen Gaskonzentrationen beobachten, was einen möglichen Wirkmechanismus nahe legt.
In Insekten werden zahlreiche physiologische Prozesse durch Neuropeptide gesteuert. Diese Insekten-Neuropeptide bzw. ihre Rezeptoren wurden bisher als insektizide Targets nur wenig beachtet. Die Gründe hierfür liegen hauptsächlich in der Problematik peptidischer Wirkstoffe, wie geringe metabolische Stabilität und problematische physikochemische Eigenschaften. Das Ziel der Arbeiten ist die Entwicklung eines nicht-peptischen, toxikologisch unbedenklichen, und artselektiven Wirkstoffs zur Bekämpfung des Baumwollschädling Heliothis virescens. Für das diuretische Neuropeptid Helicokinin I wurden mittels diverser Aminosäure-Scans dezidierte Struktur-Aktivitätsbeziehungen erarbeitet. Mittels aufwändiger NMR-Untersuchungen (Kooperation Prof. Zerbe Uni Zürich) wurden die Vorzugskonformationen der Neuropeptide Myosuppressin, Tachykinin und Helicokinin in künstlichen Membranen als Modelle für die rezeptorgebundene Konformation ermittelt. Die aufgeführten Arbeiten erlauben erstmalig die Aufstellung einer Hypothese bzgl. der 'biologisch aktiven' Konformation eines Insekten-Neuropeptids und das gezielte Design von Neuropeptid-Mimetika. Von diesem Modell abgeleitete Turnmimetika befinden sich derzeit in Bearbeitung.
Bis heute existiert keine validierte Alternativmethode, die im Rahmen der Risikobewertung von Chemikalien und Arzneistoffen sowie der toxikologischen Sicherheitsprüfung von Kosmetika den Augenirritations-Test nach Draize am lebenden Kaninchen vollständig ersetzen kann. Für Substanzen mit starkem Augenirritations-Potential kann die Toxizität anhand verschiedener, validierter in vitro Assays im Rahmen einer abgestuften, von der OECD empfohlenen Teststrategie mit hoher Genauigkeit erfasst werden (BCOP-Assay, ICE-Methode). Substanzen mit sehr mildem Augenirritations-Potential können zukünftig möglicherweise durch kommerziell erhältliche, dreidimensionale Cornea-Epithelmodelle identifiziert werden, die sich momentan in der Validierung befinden (EpiOcularTM Modell, SkinEthik HCETM Modell). Dagegen muss insbesondere die Lücke im Bereich der milden bis moderaten Augenirritation durch neue Alternativmethoden geschlossen werden. Die Überprädiktivität/ hohe Sensitivität der dreidimensionalen Epithelmodelle sowie die Forderung nach einem mechanistischen Ansatz, der die Tiefe der cornealen Verletzung durch toxische Substanzen berücksichtigt und damit ermöglicht, die gesamte Bandbreite an Schweregraden okulotoxischer Reaktionen abzudecken (Jester et al., 2001), erfordert die Einbeziehung weiterer cornealer Schichten, Stroma und Endothel, in ein organotypisches in vitro Modell der Cornea. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein solches, von Zorn-Kruppa et al. etabliertes Komplettmodell der Cornea aus drei humanen, SV40-immortalisierten Zelllinien hinsichtlich des Kulturmediums zu optimieren und diese Endothel (EC)-, Keratocyten (HCK)- und Epithel (HCE)-Zelllinie an ein gemeinsames, möglichst serumfreies Wachstumsmedium zu adaptieren. EC und HCK wurden zudem in Abhängigkeit von Art und Serumgehalt des Kulturmediums hinsichtlich der Frage, ob die organotypischen Merkmale der primären Zellen trotz der SV40-Immortalisierung erhalten geblieben sind, charakterisiert. Die EC-Zelllinie wurde auf ihre Fähigkeit zur interzellulären Kontaktinhibition untersucht, welche nach dem Erlangen der zellulären Konfluenz die Vorraussetzung zur Ausbildung und Aufrechterhaltung eines organotypischen Endothel-Monolayers darstellt (Joyce et al., 2002). Die Keratocytenzelllinie HCK wurde in Monolayer-Kultur und nach Einbettung in die collagenöse Matrix des Stroma-Äquivalents phänotypisch und funktionell sowie in Abhängigkeit von Serum und Wachstumsfaktoren charakterisiert. Insbesondere wurde die Transformation der HCK in fibrotische Phänotypen nach Stimulation mit TGF beta untersucht, welche in vivo an cornealen Wundheilungsreaktionen beteiligt sind (Fini und Stramer, 2005, Jester et al., 1999).
Piloten und FlugbegleiterInnen gehoeren zu den Personen, die einer hohen Strahlenbelastung am Arbeitsplatz ausgesetzt sind. Die kosmische Strahlung in Flughoehe besteht ausschliesslich aus Sekundaerstrahlung (hauptsaechlich Neutronen und Gammastrahlung), die in Wechselwirkung von primaeren Teilchen mit den Atomen der Lufthuelle erzeugt wird. Die Exposition des Flugpersonals ist zudem abhaengig von der Flughoehe, der geomagnetischen Breite und der solaren Aktivitaet. Aufgrund der Komplexitaet des kosmischen Strahlenfeldes ist allerdings der Umfang der Exposition schwer zu bestimmen, und physikalische Messungen geben keinerlei Hinweise auf die biologische Wirksamkeit dieser Strahlung. Ueber Chromosomenanalysen in den peripheren Lymphozyten des menschlichen Blutes konnte in einer Pilotstudie an Personal aus dem Interkontinentalverkehr eine hochsignifikant erhoehte Strahlenbelastung festgestellt werden. Die Chromosomenanalyse eines weiteren Untersuchungskollektivs, das aus einer Gruppe von Concordepiloten besteht, steht kurz vor dem Abschluss. Ergebnisse aus strahlenbiologischen Experimenten im CERN, Genf, belegten eine sehr hohe biologische Wirksamkeit der kosmischen Strahlung im Niederdosisbereich. Die Resultate dieser Versuchsreihe (in-vitro) sollen mit den Ergebnissen aus den in-vivo Ansaetzen verglichen und im Hinblick auf die biologisch Wirksamkeit kleiner Dosen von Neutronen bewertet werden. Die Ergebnisse sollen der Einfuehrung des Strahlenschutzes fuer das Flugpersonal dienen.
Ziel des Projektes ist die Prüfung der Erfolgsaussichten für Substanzen(Hefeextrakte, Chitosan) mit pflanzenstärkenden und Elicitoreigenschaften zur Stabilisierung der Erträge und Verbesserung der Pflanzengesundheit im Kartoffelbau mit dem langfristigen Ziel der Reduktion des Einsatzes von chemischen und kupferhaltigen Fungiziden. Die Ergebnisse der in vitro, im Gewächshaus, sowie im Feld unter gemäßigten und subtropischen Bedingungen durchgeführten Forschungsarbeiten bilden die Grundlage zur Ableitung von Kriterien zur Beurteilung der Effektivität von Pflanzenstärkungsmitteln sowie zur Entwicklung von Anwendungsprotokollen. Die folgenden Zwischenergebnisse können formuliert werden: Pflanzenstärkungsmittel unterscheiden sich hinsichtlich der Wirksamkeit auf Ertragsparameter sowie gegenüber Krautfäule(Phytophthora infestans) und Dürfleckenkrankheit (Alternaria solani). Die Wirkung von Pflanzenstärkungsmitteln auf Parameter von Ertrag und Pflanzengesundheit wird durch die natürlichen Bedingungen während der Anwendung modifiziert. Der Einsatz von Pflanzenstärkungsmitteln ist besonders aussichtsreich bei der Produktion von gesundem Kartoffelpflanzgut ausgehend von Gewebekulturmethoden.
Das Forschungsvorhaben widmet sich der Entwicklung und Testung von in-vitro-Methoden als Ersatz fuer schmerzhafte in-vivo-Versuche (Toxizitaets- und Stressversuche) an niederen Wirbeltieren. Aufbauend auf Untersuchungen mit Leber-Organkulturen sind die Ziele des Vorhabens: - Methoden zur Primaerzellkultur von Hepatocyten niederer Wirbeltiere (Fische, Amphibien) zu entwickeln und als Arbeitsgrundlage fuer Fragestellungen zur hormonellen Regulation des Lebermetabolismus einzusetzen. - Die Eignung von Organkulturtechniken mit Leber- und Nebennierenschnitten als Ersatz fuer oekotoxikologische Testverfahren zu klaeren. - Die Umsetzung beider Fragestellungen fuer Aufgaben in der Lehre zu erreichen.
Der UV-A/Blaulichtrezeptor Cryptochrom 2 (cry2) spielt eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Blühinduktion. Wichtige Komponenten der Signalleitung von cry2 sind mehrere nah verwandte bHLH Transkriptionsfaktoren (CIB1, CIB2, CIB4, CIB5), die Blaulicht-abhängig an cry2 binden, als Heterodimere an nicht-kanonische E-Box Motive in der Promotorregion des FLOWERING LOCUS T (FT) Gens binden und hierdurch die Expression dieses zentralen Blühgens induzieren. Weiterhin interagiert cry2 im Blaulicht mit SPA-Proteinen und inhibiert damit die Aktivität der E3 Ubiquitin Ligase CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 1 (COP1), die maßgeblich am Abbau des FT-Transkriptionsaktivators CONSTANS (CO) beteiligt ist. Wir haben gezeigt, dass der FAD-Chromophor im signalaktiven Zustand von cry2 in der neutralen Semichinonform vorliegt und die Bildung dieser Form durch Metabolite wie ATP und NADPH verstärkt wird. Gerichte und strukturbasierte Mutagenese von CRY2 lieferte Hinweise darauf, welche Aminosäuren für die Metabolit-Kontrolle erforderlich sind. Diese Information soll genutzt werden, um die Rolle dieser Metabolite bei der photoperiodischen Blühinduktion aufzuklären. Geplant ist hierfür die Expression entsprechender cry2 Allele in planta und die Analyse der generierten Pflanzenlinien hinsichtlich Blühverhalten, FT-Expression und Interaktion mit down-stream Komponenten. Diese Untersuchungen sollen durch in vitro Studien mit rekombinanten Proteinen komplettiert werden. Im Gegensatz zum Wildtyp Allel von cry1 induziert die cry1L407F Mutante gesteigerte Expression von CO und FT sowie frühes Blühen im Kurztag. In vitro Analysen zeigten ein tryptisches Spaltmuster von cry1L407F im Dunkeln, welches dem von Wildtyp cry1 im Blaulicht entspricht. Das geplante Vorhaben soll klären, ob cry1L407F die gleichen Komponenten wie cry2 für die Induktion von FT nutzt. Hierfür sind Analysen der cry1L407F Mutante im cib1/cib2/cib5 Hintergrund sowie Interaktionsstudien mit cry2 Partnern geplant. Direkte Zusammenarbeiten ergeben sich mit den Vorhaben von Christian Jung (Blühkontrolle bei Beta vulgaris) und Markus Schmid (Regulation des Blühzeitpunkts durch Trehalose-6-P).
Mehltaupilze sind obligat biotrophe Phytopathogene, die agronomisch relevant sind und in enge Beziehungen zu ihren Wirtspflanzen treten. Die Interaktion zwischen Gerste (Hordeum vulgare) und ihrem Mehltaupilz, Blumeria hordei, steht im Fokus unserer Forschungsarbeiten. In der zweiten Förderphase von FOR5116 werden wir auf den Resultaten aufbauen, die wir beim Studium der Kommunikation über extrazelluläre RNA zwischen Gerste und B. hordei während der ersten Förderperiode erhalten haben. Ein Schlüsselbefund ist die Entdeckung des Auftretens ortsspezifischer kleiner RNAs (sRNAs) in pilzlichen Hyphen und Haustorien, infizierter Epidermis der Gerste, einer angereicherten Vesikelfraktion der Epidermis, und extrazellulären Vesikeln. Außer kanonischen sRNAs der Wirtspflanze und des pilzlichen Pathogens haben wir unerwarteterweise auch eine Anreicherung spezifischer Fragmente von 5.8 ribosomaler RNA der Gerste in extrazellulären Vesikeln und infizierter Epidermis sowie spezieller Transfer-RNA-Fragmente von B. hordei in Haustorien entdeckt. Zusammenfassend deuten diese Befunde auf eine Überführung von sRNAs über Grenzen biologischer Reiche hinweg in der Gerste-Mehltau-Interaktion hin. In der zweiten Förderphase möchten wir die biologische Signifikanz dieser Ergebnisse untersuchen. Hierzu haben wir bereits ein umfangreicheres Experiment zur Erfassung der sRNAs initiiert, welches auch mRNA- und Degradom-Sequenzierungen beinhaltet, um mögliche Zielgene der sRNAs in beiden Interaktionspartnern zu identifizieren. Wir werden weiterhin selektierte sRNAs im Kontext der Interaktion überexprimieren und binden (mittels STTM-Technologie) und ihre Wirksamkeit zum Stummschalten von Genen mithilfe eines speziellen Reportersystems überprüfen. Ferner werden wir die Fähigkeit der gefundenen Transfer-RNA- und ribosomalen RNA-Fragmente, mit dem Prozess der Translation zu interferieren, untersuchen. Da robuste Marker für extrazelluläre Vesikel wichtig für zellbiologische Studien sind, werden wir eine fortgeschrittene Proteom-Analyse von angereicherten und gereinigten Fraktionen extrazellulärer Vesikel durchführen. Schließlich möchten wir die RNA-bindenden Proteine, die mit den von uns gefundenen sRNAs assoziiert sind, erkunden. Da Argonaut-Proteine hierfür offensichtliche Kandidaten sind, werden wir diese anreichern, z.B. mithilfe der neuartigen TraPR und AGO-APP-Ansätze. Wir werden auch die Untersuchung des RNase-artigen Effektorproteins BEC1015/CSEP0064 fortsetzen, welches ein Mitglied einer großen Superfamilie in B. hordei und ein vielversprechender Kandidat für sRNA-Bindung ist. Wir werden einerseits in gezielter Weise die in vitro RNA-Bindungskapazität dieses Effektorproteins testen. Andererseits werden wir fortgeschrittene CLIP-Methoden verwenden, um RNAs anzureichern, die in vivo an dieses Effektorprotein gebunden sind. Zusammengenommen versprechen diese experimentellen Ansätze, die Rolle des RNA-Transfers im Verlauf der Gerste-Mehltau-Interaktion weiter zu erhellen.
| Origin | Count |
|---|---|
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| Förderprogramm | 1016 |
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