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The production of vaccines in plants bears a frequently discussed risk factor: The containment of potentially bio-hazardous genes. Transgenes transformed to the nucleus can escape to the environment through pollen flow. We can limit the risk of pollen-mediated transgene dissemination in the first line by use of the chloroplast transformation method. The advantages of plastid transformation consist in the precision of the transgene insertion via homologous recombination, in their maternal inheritance, the high transformation predictability, and circumvention of epigenetic effects, as are silencing and methylation. By this approach we determine the potential to synthesize antigen L1 of the Human Papilloma Virus (HPV) for vaccination in tobacco plastids. Vaccines can be delivered as antigens either for peripheral or oral immunization. Transformation of plants with genes carrying selected antigens of the respective pathogen allows producing immunogenic proteins on the field with very high yields. Our goal is the production of an antigen vaccine against Human Papilloma Virus (HPV), which causes cervical cancer prestages in nearly 2 Prozent of all women in Germany. In order to synthesize the antigenic L1 epitope from HPV 16 a chloroplast transformation vector will be constructed, which will contain a synthetic expression cassette: For increased transcription: two different promoters, for enhanced translation it will carry a 5 motif from the T7 phage G10L sequence. Further the L1 gene will be N-terminally fused to the sequence codons of the first 14 amino acids of GFP (green fluorescent protein) which confers an increased translation. On transcriptional level this construct is followed by a selection cassette containing the aadA gene. Regenerating calli carrying these constructs will be selected on a medium containing spectinomycin. Positive transformants will be identified by PCR and Southern analysis. Further Western blot analysis will prove successful expression of the L1 protein. The novel transformants are then tested on correct folding of the LTB-L1 fusion protein: The recombinant protein can be identified with conformation specific antibodies which only bind when L1 proteins formed virus like capsomers. Our further work is aimed to set up an inducible antigen expression system, which is regulated through chemical induction By this work, plant transformants will be shown to be a reasonable alternative for production of vaccines. Due to these results the next step to proof the immunogenicity has the best prospects.
Ein potentielles Risiko fuer die Freisetzung rekombinanter Rhizobien besteht vor allem in der Moeglichkeit der Weitergabe rekombinanter DNS, da die Einfuehrung der Fremdgene bisher hauptsaechlich ueber Plasmide erfolgte. Ebenso ist die genetische Stabilitaet des rekombinanten Bakteriums fuer die stabile Erhaltung der uebertragenen Eigenschaften notwendig. Ziel der Arbeiten ist die Konstruktion von rekombinanten Staemmen auf der Grundlage einer chromosomalen Integration. Der Einbau heterologer DNA in Rhizobium leguminosarum soll gezielt in eine Sequenz erfolgen, die kein Merkmal fuer das Bakterium kodiert. Hierzu werden IS-Elemente isoliert, da sie nur fuer den eigenen Transfer kodieren. Der Einbau erfolgt ueber einen Austausch gegen eine charakterisierte Insertionssequenz, wobei alle fuer die Transposition essentiellen Sequenzen entfernt werden. Das Verfahren schliesst eine Anwendbarkeit innerhalb der gramnegativen Bodenbakterien ein.
Im Rahmen dieser Untersuchung soll eine kostengünstige Kohlenstoffquelle (Grasmulch) am Grünlandbetrieb getestet werden. Zu diesem Zweck wird der letzte Biomasseaufwuchs im Vegetationsjahr gemulcht und auf der Fläche belassen. Zusätzlich zum Mulchen werden zwei unterschiedliche Güllequalitäten eingesetzt. Einmal unbehandelte Rindergülle und einmal mit Diabas-Steinmehl behandelte Rindergülle.
Arthropodenpathogene Pilze der Gattung Metarhizium sind als Mittel der biologischen Bekämpfung land- & forstwirtschaftlicher Schädlinge sowie der Vektoren von Infektionskrankheiten von beträchtlichem ökonomischem Interesse. Ein fundiertes Verständnis der Infektionsbiologie dieser Organismen, zu dem das vorliegende Projekt beitragen soll, ist unabdingbare Voraussetzung der Zulassung und Anwendung entsprechender Mykoinsektizide in nachhaltiger Landwirtschaft und Vektorkontrolle. In bilateraler mexikanisch-deutscher Kooperation wurde ein Selektionssystem zur genetischen Transformation eines mexikanischen Biokontroll-Stammes der Art Metarhizium anisopliae mittels Agrobacterium tumefaciens entwickelt. Das System wurde im folgenden zur Insertionsmutagenese dieses und zweier weiterer Metarhizium-Stämme verwendet, wobei stamm-abhängig sehr große Schwankungen sowohl in Transformationseffizienz als auch Qualität der erhaltenen Transformanten, insbesondere hinsichtlich des Vorliegens von Einfach- oder Mehrfachrekombinationen, beobachtet wurden. Mehrfache Rekombinationsereignisse im selben Genom sind im Projektzusammenhang unerwünscht, da ihre genetische Analyse wesentlich aufwendiger ist als diejenige von Einfachrekombinationen. Um die weitere komparative Analyse der transformierten Stämme auf Einfachrekombinationen begrenzen zu können, wurde ein diagnostischer PCR-Ansatz zum Screening auf qualitative analysierbare Insertionsmutanten entwickelt und im mexikanischen Partnerlabor etabliert. Die Folgeanalyse der Insertionsmutanten wird derzeit in Mexiko durchgeführt.
Roggen (Secale cereale L.) ist unter den kleinkörnigen Getreidearten diejenige mit der höchsten Frosttoleranz und daher sehr gut als Modellobjekt zur Erforschung der genetischen Grundlagen der Frosttoleranz geeignet. Das Projekt erforscht die allelische und phänotypische Diversität für Frosttoleranz in Roggen - eine wichtige Voraussetzung für die genetische Verbesserung dieses Merkmals. Die Projektziele sind daher i) die Untersuchung der genetischen Grundlagen der Frosttoleranz in Roggen, ii) die Analyse von Kandidatengenen, die an der Ausprägung der Frosttoleranz beteiligt sind auf DNA-Sequenzebene, iii) die Bestimmung des Kopplungsungleichgewichts innerhalb und zwischen Kandidatengenen, iv) die Nutzung der Sequenzinformationen in einer Kandidatengen-basierten Assoziationskartierung, und v) die Identifizierung vorteilhafter Allele zur Entwicklung von molekularen Markern für die markergestützte Selektion von Roggenzuchtmaterial. Das untersuchte Pflanzenmaterial besteht aus vier osteuropäischen Populationen und einer mitteleuropäischen Population. Da Roggenpopulationen in der Regel selbstinkompatibel sind wurden 15-68 Pflanzen je Population auf eine selbstkompatible Inzuchtlinie ausgekreuzt. In den insgesamt 201 heterozygoten S0-Pflanzen ist damit jeweils ein Gamet der Ausgangspopulationen repräsentiert. Dies erleichtert die Bestimmung der Haplotypen auf DNA-Ebene. Die S0-Pflanzen wurden geselbstet um S1- bzw. S1:2-Pflanzen zu erhalten. Diese wurden über drei Jahre in mehreren Feldversuchen in Osteuropa und Kanada sowie in einer semi-kontrollierten Umwelt und in Klimakammern auf Frosttoleranz getestet. Insgesamt wurden zwölf Kandidatengene in den 201 S0-Pflanzen sequenziert und die Sequenzdiversität bestimmt. Roggen zeichnet sich durch eine hohe Sequenzdiversität aus und es wurden für die zwölf Kandidatengene 170 DNA-Sequenzpolymorphismen in Form von 161 SNPs ('single nucleotide polymorphisms') und 9 kurzen Insertionen/Deletion mit einer Allelfrequenz kleiner 0,05 gefunden. Es wurde festgestellt, dass das Kopplungsungleichgewicht in Roggen innerhalb weniger hundert Basenpaare abgebaut wird. Da Roggen ein Fremdbefruchter ist, waren diese Befunde zu erwarten. Die phänotypischen Daten der Roggenpopulationen wurden varianzanalytisch verrechnet und zusammen mit den DNA-Sequenzen in einer Kandidatengen-basierten Assoziationskartierung analysiert. Für mehrere SNPs wurde eine Assoziation mit dem Merkmal Frosttoleranz in den drei Phänotypisierungsplattformen gefunden. In weiteren Analysen sollen die allelischen Effekte der SNPs sowie die mögliche Interaktion zwischen Genen genauer untersucht werden. Für die markergestützte Selektion sollen vorteilhafte Allele der Kandidatengene identifiziert werden. In einer genomweiten Assoziationsstudie soll außerdem mit einem SNP Genotypisierungsarray mit über 5000 SNP-Markern, der im Projekt GABI RYE-EXPRESS entwickelt wurde, nach weiteren Genomregionen gesucht werden, die Frosttoleranz beeinflussen.
Based on a microchip analysis we identified several genes differentially regulated by Cd2+. In the frame of this COST action we focused on a member of the Abc1 faily, AtOSA1, and a member of the ABC transporter family, AtATH12. Up to now, Abc1-like proteins have been identified in prokaryotes and in the mitochondria of eukaryotes. AtOSA1 is the first member of this family to be localized in the chloroplasts. The atosa1-1 and atosa1-2 T-DNA insertion mutants were more affected than wild type plants by Cd2+ and revealed an increased sensitivity towards oxidative stress (H2O2) and high light. The mutants exhibited higher superoxide dismutase activities and differences in the expression of genes involved in the antioxidant pathway. In addition to the conserved Abc1 region in the AtOSA1 protein sequence, putative kinase domains were found. Protein kinase assays in gelo using myelin basic protein as a kinase substrate revealed that chloroplast envelope membrane fractions from the AtOSA1 mutant lacked a 70 kD phosphorylated protein compared to the wild type. Our data suggest that the chloroplast AtOSA1 protein is a new factor playing a role in a balance of oxidative stress. In case of AtATH12 we could show that this gene product is localized in the chloroplast. Mutant plants exhibit several phenotypes: They are more sensitive to Cd2+ and Al3+,and exhibit a chlorotic phenotype when exposed to Cd2+. Further investgations lead us to hypothesize that AtATH12 is involved in iron transport and homeostasis. Actually we are performing experiments to look at this aspect more in detail.
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| Förderprogramm | 21 |
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