Die Gewebsspiegel toxischer Metabolite werden im wesentlichen durch eine Balance bestimmt zwischen Phase I-Enzymen des Fremdstoffmetabolismus (zB P450-abhaengige Oxidation) mit oft giftender Wirkung und Phase II-Enzymen (Konjugation mit zB Glucuronsaeure) mit haeufig entgiftender Wirkung. Da diese Balance durch Induktion dieser Enzyme empfindlich gestoert werden kann, sollen die Bedingungen und das Ausmass einer Coinduktion bzw einer unabhaengigen Regulation von Phase I- und II-Enzymen untersucht werden. Eine moegliche Coinduktion soll zunaechst am Beispiel der durch 3-Methylcholanthren (MC)-induzierbaren Isozyme des P450 und der UDP-Glucuronyltransferase (UDPGT) studiert werden. Die Coinduktion koennte Hinweis auf eine moegliche physiologische Rolle adaptiver Programme liefern. Dabei sollen (1) moeglichst selektive funktionelle und molekulare Marker fuer die Isozyme eingesetzt werden. (2) Es sollen hepatische und extrahepatische Gewebe (zum Beispiel Niere) und insbesondere verschiedene Zellkultursysteme (primaere Hepatozyten, verschiedene Zellinien) verglichen werden. (3) Neben dem Tiermodell sollen auch menschliche Gewebe untersucht werden. Dabei muessen zunaechst die durch MC-Typ-Induktoren induzierbaren Isozyme der UDPGT identifiziert werden sowie funktionelle und molekulare Marker fuer dieses Isoenzym entwickelt werden. Ausmass und genetische Variation der Induktion und Coindukton dieser Enzyme soll auch bei freiwilligen Probanden in vivo untersucht werden. Dabei sollen nichtinvasive Tests (Koffein-Test fuer P450 und Paracetamol-Test fuer UDPGT) bei Rauchern angewandt und weiterentwickelt werden.
Wesentliche Voraussetzung für das Gesamtvorhaben ist die Beprobung von jeweils 20 Vorkommen der beiden Modellarten Prunus spinosa und Corylus avellana in Deutschland und Süd- bzw. Südosteuropa. Während die Auswahl der Vorkommen mit Beteiligung aller Projektpartner erfolgt, wird die Beprobung vollständig von ISOGEN übernommen. Dabei ist Probenmaterial in ausreichender Menge und Qualität für genetische Untersuchungen sowie für die Anlage der Klonarchive bereitzustellen. Im Bereich der Untersuchung genetischer Marker übernimmt ISOGEN die Reihenuntersuchungen an Isoenzymen und AFLPs, Genmarker finden seit vielen Jahren als unverzichtbares Instrument im Bereich der Erhaltung genetischer Ressourcen Verwendung. Allgemein werden sie bei der Messung genetischer Vielfalt und Diversität innerhalb von Vorkommen, sowie der Messung genetischer Unterschiede zwischen Vorkommen und Regionen eingesetzt. Sie sind unverzichtbares Hilfsmittel für die Ausweisung und das Management genetischer Ressourcen (GEBUREK and TUROK 2005). Im Rahmen des hier beantragten Projektes steht dabei die geografisch/genetische Differenzierung von Herkünften im Vordergrund. Bei Untersuchungen von Schlehenvorkommen in Niedersachsen konnte mit Hilfe von Isoenzym-Genmarkern eine außergewöhnlich hohe genetische Differenzierung von Vorkommen nachgewiesen werden (KLEINSCHMIT et al. 2008). Untersuchungen in natürlichen Vorkommen mit Hilfe von AFLP-Fingerprint-Methoden wurden für beide Arten bisher nicht durchgeführt, lediglich für C. avellana sind erste Analysen zur Sortenidentifizierung bekannt (FERRARI et al. 2005). Dieses universelle d.h. auf beliebige Arten anwendbare Verfahren gewährleistet eine hohe Repräsentativität bzgl. des untersuchten Genoms. Dabei wird eine Vielzahl zufälliger Abschnitte aus dem Genom untersucht. Untersuchungen an verschiedenen Baumarten zeigten eine gute Eignung dieser Methode zur geographisch genetischen Differenzierung von Baumarten (CAO et al. 2006, LARA-GOMEZ et al. 2005, PAPAGE
Ziel des Projektes ist es zu sehen, ob unterschiedliche Reaktionen auf Trockenheit bei Rotbuche (Fagus sylvatica) und Schwarzkiefer (Pinus nigra) genetisch bedingt sind und ob auf dem Wege genetischer Untersuchungen eine Auswahl von Herkünften mit erhöhter Trockenresistenz getroffen werden kann. Im Projekt sollen DNA- und Isoenzymuntersuchungen durchgeführt werden. Zur Bestimmung der genetischen Diversität in den einzelnen Populationen kommen Mikrosatelliten-Genmarker der Kern-DNA und Isoenzymgenmarker zum Einsatz. So wird geprüft, wie hoch die genetische Diversität innerhalb der Populationen ist und wie stark sich die Populationen voneinander genetisch unterscheiden. Um der Frage nach anpassungsrelevanten Trockenstressgenen nachzugehen werden SNPs (single nucleotid polymorphisms) in Kandidatengenen untersucht. Dies geschieht durch die Sequenzierung bestimmter DNA-Abschnitte. Dadurch wird die Nukleotidabfolge in diesen DNA-Abschnitten bestimmt, Änderungen bei einem einzigen Nukleotid werden erkannt. Die statistische Auswertung erfolgt mit spezifischer Software. Einserseits werden über Bayesische Analysemethoden (STRUCTURE, BAPS) und über paarweise FST-Werte (Alequin) die populationsgenetische Struktur und demografische Einflüsse auf die Herkünfte basierend auf neutralen Markern abgeschätzt. Andererseits wird die genetische Diversität der Kandidatengene innerhalb der Herkünfte berechnet und ebenfalls demografische Einflüsse abgeschätzt (Arlequin, DnaSP). Weiters wird über 'Neutralitätstests' festgestellt, ob positive Selektion auf die Kandidatengene innerhalb der Herkünfte gewirkt hat.