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Biologische und chemisch-analytische Charakterisierung des allergenen Potentials von Terpenen, Terpenmetaboliten und Terpenoxidationsprodukten

Die zunehmende Verwendung von Monoterpenen wie vor allem d-Limonen, a-, b-Pinen, 3-Caren und a-Terpinen in Produkten aus dem Bereich der Körperpflege, terpenhaltigen Medikamenten, sowie der vermehrte Einsatz von terpenhaltigen Naturstoffen als Baumaterialien in Innenräumen bildet möglicherweise eine wesentliche Ursache für das steigende Auftreten der entsprechenden Sensibilisierungen. Zwischen 1995 und 1999 stieg die Anzahl der sensibilisierten Patienten von 0,5 auf 2,9 Prozent. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind wenig verstanden. In diesem Forschungsvorhaben sollen vergleichende in vitro und in vivo Untersuchungen Ansätze zur Klärung dieses sozialmedizinisch bedeutsamen Problems liefern. Exemplarisch sollen hierzu die Terpene, a-Terpene, d-Limonen und 3-Caren auf ihr allergenes Potential für Blutleukozyten bzw. T-Lymphozyten der Haut auf polyklonaler und monoklonaler Ebene analysiert werden. Daneben soll die transiente Genexpression durch die Substanzen in Antigen-präsentierenden Zellen ermittelt werden und gleichzeitig die dafür relevanten Metabolite und Oxidationsprodukte identifiziert werden. Dabei soll geklärt werden, welchen Anteil einzelne Metabolite und Oxidationsprodukte bzw. Kombinationseffekte im Vergleich zu den Ausgangssubstanzen an den in vivo Befunden haben. Diese Untersuchungen werden grundlegende Hinweise zum Wirkmechanismus der Substanzen liefern und dadurch Ansätze für die Bewertung der gesundheitlichen Auswirkungen von Monoterpenexpositionen in umweltrelevanten Konzentrationen bieten.

Charakterisierung bioenergetischer Prozesse in mononukleären Leukozyten hochleistender Milchkühe mit positiver und negativer Energiebilanz

Ziel des Vorhabens ist die Quantifizierung bioenergetischer Prozesse während der Aktivierung mononukleärer Leukozyten aus dem peripheren Blut (PBMC) und deren Beziehung zum Energiestatus des Tieres und zu den immunoregulatorischen Blutparametern bei Hochleistungskühen in der peripartalen Phase von -8 bis +12 Wochen relativ zur Kalbung. Normale und überkonditionierte Kühe werden verglichen, letztere sind durch eine ausgeprägtere negative Energiebilanz gekennzeichnet und haben ein höheres Risiko für Infektionskrankheiten. Zur Charakterisierung der bioenergetischen Prozesse des PBMC Stoffwechsels werden die Zellrespiration und Zelladhäsion und der Beitrag und die Hierarchie verschiedener funktionaler Komponenten (Ionentransport, Makromolekülsynthese) quantifiziert. Die Messung der Tierrespiration mittels indirekter Kalorimetrie während ad libitum und restriktiver Fütterung dient der Berechnung des gesamten Energieumsatzes, des Ruheumsatzes und der Energiebilanz. Es wird erwartet, dass Unterschiede in den bioenergetischen Prozessen des PBMC Stoffwechsels zwischen den Tiergruppen im Zusammenhang stehen mit Unterschieden in der Energiebilanz und im Energieumsatz. In diesem Projekt werden klassische Methode mit neuen innovativen Ansätzen auf der in vivo und in vitro Ebene kombiniert. Die Ergebnisse dieses systemischen Ansatzes zum Zusammenhang des Energieumsatzes der Immunzelle und des Tieres sind von allgemeiner Relevanz für die Grundlagenforschung und potentiell auch für die angewandte (landwirtschaftliche) Forschung von Interesse.

Endothelzellen: Effekte niedriger, mittlerer und hoher Strahlendosen auf primäre mikrovaskuläre Endothelzellen unterschiedlicher Normalgewebe^Teilprojekt B, Teilprojekt A

Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es, die Wirkung niedriger, mittlerer und hoher Dosen ionisierender Strahlung in einem Bereich zwischen 0,2 Gy und 16 Gy auf mikrovaskuläre Endothelzellen (mECs) gewonnen aus unterschiedlichen Normalgeweben zu studieren. Im Besonderen sollen die Interaktionen zwischen mikrovaskulären ECs und Immuneffektorzellen in vitro und im Mausmodell untersucht werden. Wir werden uns auf Herz, Subkutis, Leber (Sievert et al. 2014; Hildebrandt et al. 1998) und die Lunge als Hochrisiko-Organe konzentrieren. Aufklärung der funktionellen und phänotypischen Änderungen von pathogener Relevanz in mikrovaskulären Endothelzellen (mECs) isoliert aus Herz, Haut, Leber und Lunge (Sievert et al. 2014). Interaktion von mECs (nicht bestrahlt und bestrahlt) mit Subpopulationen von Leukozyten. Erfassung der histologischen und immunhistologischen Änderungen von nicht bestrahlten und mit niedrigen Dosen bestrahlten mECs. Vergleichende Proteom- und Transkriptom-Anlalyse von mECs aus nicht bestrahlten Geweben. Integrierung der Daten zu einem Modell über den biologischen Mechanismus der strahleninduzierten Pathogenese (Azimzadeh et al. 2015).

Endothelzellen: Effekte niedriger, mittlerer und hoher Strahlendosen auf primäre mikrovaskuläre Endothelzellen unterschiedlicher Normalgewebe, Teilprojekt B

Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es, die Wirkung niedriger, mittlerer und hoher Dosen ionisierender Strahlung in einem Bereich zwischen 0,2 Gy und 16 Gy auf mikrovaskuläre Endothelzellen (ECs) gewonnen aus unterschiedlichen Normalgeweben zu studieren. Im Besonderen sollen die Interaktionen zwischen mikrovaskulären ECs und Immuneffektorzellen in vitro und im Mausmodell untersucht werden. Wir werden uns auf Herz, Subkutis, Leber (Hildebrandt et al. 1998) und die Lunge als Hochrisiko-Organe konzentrieren. Aufklärung der funktionellen und phänotypischen Änderungen von pathogener Relevanz in mikrovaskulären Endothelzellen (mECs) isoliert aus Herz, Haut, Leber und Lunge. Interaktion von mECs (nicht bestrahlt und bestrahlt) mit Subpopulationen von Leukozyten. Erfassung der histologischen und immunhistologischen Änderungen von nicht bestrahlten und mit niedrigen Dosen bestrahlten mECs. Vergleichende Proteom- und Transkriptom-Analyse von ECs aus nicht bestrahlten Geweben. Integrierung der Daten zu einem Modell über den biologischen Mechanismus der strahleninduzierten Pathogenese.

Entwicklung von Guidelines zur (immun)toxikologischen Charakterisierung von medizinischen Nanopartikeln

Organotypische Schnittkulturen humaner Tonsillen: Etablierung eines dem Tierversuch überlegenen Modellsystems für die immunologische Grundlagenforschung und die Zulassungsprüfung neuer Pharmaka^Teilprojekt 2, Teilprojekt 1

Ziel des Projektes ist es, ein Prüfsystem für neue 'Biologicals' zu schaffen. Dieses Prüfsystem kann den prädiktiven Wert insbesondere von Affenexperimenten für die Zulassung von 'first-in-human' Phase I-Studien vor Versuchsbeginn bestimmen. Darüber hinaus kann dieses System auch für die bislang meist in Mäusen durchgeführte immunologische Grundlagenforschung eingesetzt werden, um nicht von Speziesunterschieden verfälschte Konzepte für das humane Immunsystem zu entwickeln. Schließlich können sich Hinweise für prinzipielle Wirkunterschiede bestimmter Antikörpersubklassen im Primaten versus Menschen ergeben, so dass es wenig Sinn macht, solche Pharmaka zukünftig überhaupt in Affen zu testen. Der methodische Ansatz ist dabei so gewählt, dass durch die Kombination der Methoden (Live-Imaging, Zellisolation aus Schnittkulturen, MACS, FACS, ELISA, Gen-Array) völlig neue, im Tierexperiment nicht durchführbare Analysen möglich werden. Humane Tonsillenkulturen werden zunächst TGN1412, dann mit weiteren mAbs behandelt und die Effekte mittels ELISA anhand der Überstände, die sequentiell über mehrere Tage aus derselben Kultur gewonnen werden, analysiert. Als Kontrollsubstanz kommt das klinisch schon eingesetzte Muronomab zum Einsatz. Zusätzlich werden durchflußzytometrische Veränderungen der Expression von Oberflächenproteinen auf verschiedenen Leukozytenpopulationen dargestellt. Durch Arrays, von aus der Schnittkultur isolierten Zellen, werden Expressionveränderungen von Kandidatengenen untersucht, aber auch unerwartete Gene erfaßt, die dann alle durch qPCR validiert werden. Die Verwertung der angestrebten Innovation liegt in der Grundlagenforschung und Zulassung für die klinische Prüfung von Pharmaka. Aufgrund unserer bisherigen Erfahrung können wir davon ausgehen, dass sich unsere Methode wegen der dem Tierexperiment weit überlegenen Analysemöglichkeiten nach entsprechenden Publikationen verbreiten wird. Nach der Validierungsphase möchten wir die Methode gezielt verbreiten

Organotypische Schnittkulturen humaner Tonsillen: Etablierung eines dem Tierversuch überlegenen Modellsystems für die immunologische Grundlagenforschung und die Zulassungsprüfung neuer Pharmaka, Teilprojekt 2

Tumor-induzierte Angiogenese in Tumor-Stammzell Konfrontationskulturen: Die Bedeutung von Leukozyten und eines pro-inflammatorischen Tumor-Mikromilieus für die Tumor-Angiogenese

Chemische und biologische Untersuchungen zum allergenen Potential von Terpenen, Terpenmetaboliten und Terpenoxidationsprodukten

Die zunehmende Verwendung von Monoterpenen wie vor allem d-Limonen, -, -Pinen, 3-Caren und -Terpinen in Produkten aus dem Bereich der Körperpflege, terpenhaltigen Medikamenten, sowie der vermehrte Einsatz von terpenhaltigen Naturstoffen als Baumaterialien in Innenräumen bildet möglicherweise eine wesentliche Ursache für das steigende Auftreten der entsprechenden Sensibilisierungen. Zwischen 1995 und 1999 stieg die Anzahl der sensibilisierten Patienten von 0,5 auf 2,9 Prozent. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind wenig verstanden. In diesem Forschungsvorhaben sollen vergleichende in vitro und in vivo Untersuchungen Ansätze zur Klärung dieses sozialmedizinisch bedeutsamen Problems liefern. Exemplarisch sollen hierzu die Terpene - Terpinen, d-Limonen und 3-Caren auf ihr allergenes Potential für Blutleukozyten bzw. T-Lymphozyten der Haut auf polyklonaler und monoklonaler Ebene analysiert werden. Daneben soll die transiente Genexpression durch die Substanzen in Antigen-präsentierenden Zellen ermittelt werden und gleichzeitig die dafür relevanten Metabolite bzw. Oxidationsprodukte identifiziert werden. Dabei soll geklärt werden, welchen Anteil jeweils die Terpene selbst, einzelne Metabolite und Oxidationsprodukte oder Kombinationseffekte ursächlich an der enormen Steigerung der in vivo Befunde beteiligt sind. Diese Untersuchungen werden grundlegende Hinweise zum Wirkmechanismus der Substanzen liefern und dadurch Ansätze für die Bewertung der gesundheitlichen Auswirkungen von Monoterpenexpositionen in umweltrelevanten Konzentrationen bieten.

Bestimmung des Risikopotentials bodengebundener Schadstoffe für den Menschen im Minischwein-Modell mit Cytochrom P450-Enzymen als Effektbiomarker

Nach oraler Exposition gegenüber PAK-belasteten Böden haben wir den Effektbiomarker CYP1A1, ein fremdstoffmetabolisierendes Cytochrom P450, enzymatisch und immunchemisch in verschiedenen Geweben von Minischweinen bestimmt. Parallel wurde eine nicht-exponierte Kontrollgruppe untersucht. Zudem wurden die im Minischwein gemessenen Effekte mit denen entsprechender Versuche im Rattenmodell verglichen. Als wesentliche Ergebnisse der Studie sind hervorzuheben: (1) Die deutliche Induktion von CYP1A1 durch orale PAK-Dosen, die im realistischen Bereich der Aufnahme durch Menschen insbesondere von Kindern liegen. (2) Die Induktion von CYP1A1 nicht nur im primär resorbierenden Organ, dem Duodenum, sondern auch in Leber, Niere, Lunge und Milz. (3) Der gravierende Unterschied im organspezifischen Antwort-Profil der CYP1A1-Induktion zwischen Minischwein und Ratte. Im Detail wurden die folgendenden Ergebnisse erzielt: - CYP1A1 wird konstitutiv in Leber, Niere und Duodenum von Minischweinen nicht oder in nicht nennenswertem Umfang exprimiert. - Nach oraler Aufnahme PAK-kontaminierter Böden kommt es zu einer dosisabhängigen CYP1A1-Induktion in Duodenum, Leber und Niere. - Niedrig-belastete Böden, die nur geringe Effekte in der Leber hervorrufen, können eine deutliche CYP1A1-Induktion im Duodenum bewirken. - In Leukozyten von Minischweinen konnte eine Induktion von CYP1A1 auf Proteinebene nach Aufnahme kontaminierter Böden nachgewiesen werden. - Exemplarisch wurde an einer Expositionsgruppe von Minischweinen gezeigt, dass eine orale PAK-Aufnahme zu deutlichen Induktionseffekten selbst in Lunge und Milz führen kann. - Hinsichtlich der Induktion von CYP1A1 in verschiedenen Organen zeigen Ratten und Minischweine unterschiedliche Antwortprofile. Während oral aufgenommene PAK beim Minischwein zu einer deutlichen CYP1A1-Induktion im Dünndarm führen, wird die Expression von CYP1A1 im Darm von Ratten nur geringfügig erhöht. Umgekehrt kommt es aber in der Leber von Ratten zu einer stärkeren Induktionsantwort als in der Leber von Minischweinen. - Im Rattenmodell konnten wir zeigen, dass sich die Art und Weise der täglichen oralen PAK-Aufnahme deutlich auf das Ausmaß der CYP1A1-Induktion auswirkt. Schlußfolgerungen: Da die von uns eingesetzten Bodendosierungen im Bereich möglicher Aufnahmemengen für im Freien spielende Kinder liegen und zudem deutliche Induktionseffekte in verschiedenen Organen hervorrufen, haben die Untersuchungsergebnisse Bedeutung für Abschätzungen des Humanrisikos und sollten deshalb Anstoß zur Entwicklung entsprechender in vitro-Testmethoden sein. Die Unterschiede in den Induktionsantworten zwischen Minischwein und Ratte verdeutlichen die Problematik der Identifizierung eines geeigneten Tiermodells für den Menschen im Hinblick auf Schadstoffexpositionen. Hier ist noch Grundlagenarbeit nötig.

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