Bei der Verwendung von E.coli als 'Standard'-Wirtsorganismus für die Durchmusterung von metagenomischen Genbanken mit funktionsbasierten Screeningmethoden ist die Detektionsausbeute eingeschränkt auf solche heterologen Umweltgene, die in E.coli auch exprimiert werden. In diesem Projekt soll das extrem thermophile Bakterium Thermus thermophilus als alternativer Wirtsorganismus weiter entwickelt und dessen Potential für das funktionelle Screening von Umweltgenbanken nach Genen für industriell relevante Enzyme erkundet und eingesetzt werden. Weitere Ziele umfassen die Expression interessant erscheinender Gene, die Charakterisierung der davon kodierten Enzyme und die Auslotung der Anwendbarkeit dieser Enzyme für biotechnologische Prozesse. Vorgehensweise: Das neue Thermus Wirt/Vektor-System soll in verschiedenen Punkten verbessert werden (Optimierung der Transformationsmethodik; proteasefreie Stämme; Einsetzbarkeit sowohl bei hohen, als auch bei moderaten Temperaturen; verbesserte Selektionsmarker; Überexpression in Thermus). In einem vergleichenden Screening-Experiment soll ein und dieselbe Metagenom-Genbank in T.thermophilus und parallel (bei anderen Verbundpartnern) auch in anderen Wirtsorganismen nach Esterase-Genen durchforstet werden. Daneben soll das neue T.thermophilus Wirt/Vektor-System für die Suche nach anderen industriell relevanten Enzymen (z.B. Amadoriasen, Monooxygenasen) eingesetzt werden.
Im Rahmen des MetaCat-Konsortiums wird die Biodiversität ausgenutzt, um neue und robuste industriell relevante Biokatalysatoren zu identifizieren und isolieren. Im Fokus stehen dabei promiske Enzyme, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Substraten unter Prozessbedingungen mit hoher Stereoselektivität umsetzen können. Von besonderem Interesse sind dabei Enzyme, die Substrate mit großen Substituenten umsetzen und eine hohe Stabilität aufweisen. Zu den gesuchten Enzymklassen gehören Nitrilasen, Transaminasen, Ketoreduktases, Glycosyl-Hydrolasen und Lipasen/Esterasen. Zur Identifizierung werden aktivitäts- und sequenzbasierte sowie zellfreie Screeningsysteme verwendet. Im Rahmen dieses Teilvorhabens sollen Gene und Genprodukte für Ketoreduktasen identifiziert werden, die große (bulky) Substrate umsetzen können und promisk sind. Die gesuchten Enzyme sollen sperrige Ketone/Alkohole als Substrate akzeptieren. Das sind Ketone, die auf beiden Seiten der Carbonylfunktion große Reste tragen. Beispielmoleküle hierfür sind Benzil oder Biaryle, die gegebenenfalls mit Halogenen substituiert sind. In diesem Teilvorhaben sollen Gene bzw. Enzyme, die diese sperrigen Ketone umsetzen können, durch sequenz- und funktionsbasierte Screeningverfahren identifiziert werden. Als Quellen hierfür werden eine bereits vorhandene Gen-/Enzymbank sowie nach selektiver Voranreicherung neu erstellte Genbanken eingesetzt. Die dabei erhaltenen Kandidaten werden molekular und/oder initial biochemisch charakterisiert. Besonders vielversprechende Kandidatenenzyme werden umfassend charakterisiert. Moderat thermostabile Enzyme werden dabei bevorzugt, da Thermostabilität häufig mit einer erhöhten Lösemittelstabilität, die von besonderem Interesse für die Industriepartner ist, einhergeht. Ferner erhöht eine Umsetzung bei erhöhten Temperaturen die Löslichkeit der Substrate.