Das Projekt "Kontrolle des Blühzeitpunktes durch Trehalose-6-Phosphat" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie durchgeführt. Im Lebenszyklus einer Pflanze ist die Blühinduktion von zentraler Bedeutung. Gerade wegen seiner Wichtigkeit steht das Blühen unter der Kontrolle eines komplexen genetischen Netzwerkes, das endogene Signale (Hormone, Kohlenhydrate, Alter) und Umweltsignale (Temperatur, Tageslänge) miteinschließt. Unter induktiven Tageslängen wird das Schlüsselgen der Blühinduktion FLOWERING LOCUS T (FT) in der Vaskulatur der Blättern induziert und löst als Langstreckensignal im Apikalmeristem die Blütenbildung aus. Vom Dissacharid Trehalose-6-Phosphat konnte gezeigt werden, dass es in der Koordination von Kohlenhydratstatus und Entwicklungsprozessen als Signalmolekül fungiert. Arabidopsis thaliana Pflanzen, denen das TREHALOSE 6-PHOSPHAT SYNTHASE1 (TPS1) Gen fehlt, blühen außerordentlich spät. Kürzlich konnten wir zeigen, dass der TPS1/T6P-Signalweg die Expression verschiedener Blühzeitpunkt-regulierender Gene kontrolliert. In der Vaskulatur des Blattes ist das T6P/TPS1 Signal zur Induktion von FT unabdingbar, wohingegen im Sproßapikalmeristem MIR156 und dessen Zieltranskripte der SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE (SPL)-Gene das Ziel des T6P/TPS1 Signals darstellen. Gemeinsam stellen die umweltabhängigen (photoperiodischen) und physiologischen (T6P/TPS1) Signale sicher, dass das Blühen nur unter optimalen Bedingungen eingeleitet wird, das heißt wenn die Tageslänge eine Mindestlänge überschreitet und der Kohlenhydrathaushalt die energieaufwändige Blühinduktion und die Produktion von Samen gewährleisten kann. Dennoch bleiben viele Fragen die Funktion des T6P/TPS1 Signals betreffend offen. In diesem Antrag schlagen wir eine Serie von Experimenten vor, mit dem Ziel das T6P/TPS1 Signal besser in die Signalwege der Blühzeitpunktregulation einzubinden. Aus unseren Vorarbeiten ergibt sich, dass der T6P/TPS1-Signalweg das Blühen teilweise durch die Zellzyklus-abhängige Modulation der Stammzellanzahl im Meristem reguliert - ein zuvor unerforschter Aspekt, den wir weiter untersuchen werden. Außerdem konnte wir zeigen, dass T6P/TPS1 die Fähigkeit von Pflanzen auf Änderungen der Umgebungstemperatur zu reagieren, ebenso beeinflusst wie die Reaktion auf längere Kälteperioden (Vernalisation). Darauf aufbauend werden wir die Interaktion des T6P/TPS1-Signalweges mit der Temperatur-abhängigen Regulation des Blühens untersuchen. Abgesehen von den oben erwähnten Experimenten, die sich auf bekannte Gene und Signalwege fokussieren, werden neue Komponenten des T6P/TPS1-Signalweges identifiziert werden. Zu diesem Zweck haben wir bereits eine umfassende genetische Sichtung durchgeführt, um Suppressoren des späten Blühens der tps1-Mutante zu identifizieren. Als Teil des Schwerpunktprogramms werden wir die zugrundeliegenden Gene identifizieren, diese umfassend charakterisieren und in den T6P/TPS1-Signalweg integrieren. Zusammenfassend werden die geplanten Experimente wertvolle Hinweise zur Integration des Kohlenhydrathaushalts der Pflanzen in die Signalwege der Blühinduktion liefern.
Das Projekt "Teilprojekt Uni Ulm" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Ulm, Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie durchgeführt. Die globale Erderwärmung und die Versorgung mit Treibstoffen und Basischemikalien aus fossilen Quellen erfordern die Entwicklung alternativer, nachhaltiger Synthesewege für solche Substanzen. Biotechnologische Verfahren bieten eine Lösung, allerdings nur mit Substanzen, die nicht mit der menschlichen Ernährung konkurrieren. Neben Lignocellulose kommen dafür nur Gase wie CO2 oder CO in Frage. Hier soll CO2 mit Hilfe rekombinanter autotropher acetogener Bakterien in die industriell wichtige Plattformchemikalie 3-Hydroxypropanoat umgewandelt werden. Das ermöglicht eine kostengünstige Herstellung dieser Substanz, für die es keine ökonomisch tragfähige Synthese aus Rohölprodukten gibt, und die Reduktion eines bedeutenden Treibhausgases. Das Gen für Pyruvat-Synthase aus Acetobacterium woodii wird durch PCR amplifiziert und in einen geeigneten Schaukelvektor subkloniert (pJIR750). Zur Expression wird der Promoter des Acetat-Kinase-Gens aus A. woodii verwendet. Dann wird das Gen für Lactat-Dehydrogenase amplifiziert und subkloniert. Als Wirt für dieses Gen dient z.B. Clostridium acetobutylicum. Das dritte Gen kodiert eine Coenzym A-Transferase (Katalyse der Reaktionen: Lactat in Lactyl-CoA und 3-Hydroxypropanoyl-CoA in 3-Hydroxypropanoat). Als Wirt dient Megasphaera elsdenii. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Das vierte Gen kodiert eine Lactyl-CoA-Hydratase (Katalyse der Reaktion: Lactyl-CoA in Acrylyl-CoA). Als Wirt dient M. elsdenii. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Das fünfte Gen kodiert eine Acrylyl-CoA-Hydratase (Katalyse der Reaktion: Acrylyl-CoA in 3-Hydroxypropanoyl-CoA). Als Wirt dient Chloroflexus aurantiacus. Es folgen Amplifikation und Subklonierung. Analoge Gene werden auch aus C. propionicum, C. homopropionicum und C. neopropionicum kloniert und analysiert, um möglicherweise Patente zu generieren. Zum Schluss erfolgen Optimierung von Operon-Struktur und -Expression sowie Produktionstest in Laborkulturen und Kleinfermentern.
Das Projekt "Teilprojekt KIT" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Institut für Bio- und Lebensmitteltechnik, Bereich II: Technische Biologie durchgeführt. Ziel des Vorhabens ist die Entwicklung einer neuen mikrobiologischen Methode zur nachhaltigen, kosten-effektiven und umweltfreundlichen Produktion von Wasserstoff aus Industrie-Abgasen und Synthesegasen ohne vorherige Entfernung von Rest-Sauerstoff. Anaerobe, thermophile, CO-oxidierende Mikroorganismen können mit der Wasser-Gas-Shift-Reaktion, CO aus Synthesegas und Industrie-Abgasen in H2 umwandeln. Sie nutzen hierzu den Enzymkomplex aus einer CO-Dehydrogenase und einer Energie-konvertierenden-Hydrogenase (ECH). Mit Hilfe genomischer Analysen konnte die Anwesenheit einer ECH in dem aeroben thermophilen Geobacillus thermoglucosidans nachgewiesen werden und unsere Vorversuche zeigten, dass dieses Bakterium tatsächlich auch unter aeroben Bedingungen CO zu Wasserstoff umwandeln kann. Daher könnte sich dieser Stamm für einen Prozess zur kommerziellen H2-Produktion aus Industrie-Abgasen ohne vorherige Entfernung von Rest-Sauerstoff eignen. Zunächst soll das Wachstums und die H2-Produktion verschiedener Stämme von G. thermoglucosidans charakterisiert und auf die H2-Bildung hin in Fermentationen von 250 ml bis 15 L optimiert werden. Der optimale Stamm soll genetisch charakterisiert und die CODH- und ECH-Gene hinter einen starken Promoter kloniert werden, um die Expression zu optimieren. Die biochemischen Eigenschaften und die Expression des CODH-ECH-Enzym-Komplexes sollen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen charakterisiert werden. Die in diesem Stamm vorhandenen Mikrokompartimente sollen aufgereinigt und in Bezug auf die H2-Bildungsfähigkeit hin untersucht werden. Die Proteinreinigung muss wegen des wahrscheinlich O2-empfindlichen CODH-ECH-Enzym-Komplexes unter anaeroben Bedingungen erfolgen. Andere O2-empfindliche Enzyme sollen in den Mikrokompartimenten exprimiert werden. Abschließend soll der genetisch optimierte Stamm unter optimierten Fermentationsbedingungen im großen Maßstab fermentiert werden und der Gasverbrauch sowie die Ausbeute bestimmt werden.
Das Projekt "Activation tagging in aspen using an inducible two component Ac/Ds-enhancer element system" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Johann Heinrich von Thünen-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ländliche Räume, Wald und Fischerei, Institut für Forstgenetik durchgeführt. Based on the Ac/Ds two element transposition system from maize an activation tagging approach is suggested for the hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides) line -Esch5-. The proposed approach is based on results obtained from our earlier work on the genetic transfer of the maize transposable element Ac and its functional analysis in hybrid and pure aspen lines. It was shown that the Ac element is active in aspen and reintegrates elsewhere in genomic regions in high frequency. However, a two element transposon tagging system where Ac and Ds are put together in crosses is not feasible in trees due to the in part long vegetative phases. To overcome this barrier, an inducible two element Ac/ATDs element system is suggested to induce activation tagged variants following two independent transformation steps. In combination with a 35S enhancer tetramer and outward facing two CaMV 35S promoter located near both ends of the ATDs element, expression of genes can be elevated which are located adjacent to the new integration site of the element. As selective marker for ATDs transposition, both knocking-out the expression of a phenotypic marker (rolC gene) and a negative selection marker gene (tms) are considered. Thus, the transposition can easily be screened in primary transgenic lines.
Das Projekt "Erzeugung von langkettigen Hydroxyfettsaeuren in transgenem Raps" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Hamburg, Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten durchgeführt. Es sollen langkettige Hydroxyfettsaeuren im Samenoel transgener Rapspflanzen erzeugt werden. Aus einer samenspezifischen cDNA-Genbank werden dazu kodierende Sequenzen fuer eine Fettsaeurehydroxylase und fuer eine Hydroxyfettsaeure-spezifische Acyl-CoA Synthetase, die zur effektiven Aktivierung der Hydroxyfettsaeuren notwendig ist, kloniert und charakterisiert. Beide Gene werden dann unter der Kontrolle von samenspezifischen Promotoren mit Hilfe des durch Agrobakterium vermittelten Gentransfers in Raps ueberfuehrt. Als Zielpflanzen dienen dabei Linien mit hohem Gehalt an Erucasaeure.
Das Projekt "Natural variation of flowering time due to cis-regulatory evolution of FLOWERING LOCUS T and its orthologs and paralogs in Brassica napus" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung, Abteilung Entwicklungsbiologie der Pflanzen durchgeführt. In many plant species, FLOWERING LOCUS T and related proteins are the mobile signal that communicates information on photoperiod from the leaves to the shoots, where the transition to flowering is realized. FT expression is tightly controlled at the transcriptional level so that it is restricted to leaves, occurs only in appropriate photoperiods, and integrates ambient temperature and developmental cues, as well as information on biotic and abiotic stress. We previously established that FT transcription in the model plant Arabidopsis thaliana requires proximal promoter cis-elements and a distal enhancer, both evolutionary conserved among Brassicacea species. In addition, FT transcription is blocked prior vernalization in biannual accessions and vernalization-dependency of FT is controlled through a CArG-box located in the first intron that binds the transcriptional repressor FLOWERING LOCUS C (FLC). Chromatin-mediated repression by the Polycomb Group (PcG) pathway is required for photoperiod-dependent FT regulation and participates in FT expression level modulation in response to other cues.In this project, I propose to explore the available sequence data from the 1001 genome project in Arabidopsis to evaluate how often changes in regulatory cis-elements at FT have occurred and how these translate into an adaptive value. Allele-specific FT expression pattern will be measured in F1 hybrids of different accessions in response to varying environmental conditions. FT alleles that show cis-regulatory variation will be further analyzed to pinpoint the causal regulatory changes and study their effect in more detail. The allotetrapolyploid species Brassica napus is a hybrid of two Brassiceae species belonging to the A- and C-type genome, which are in turn mesopolyploid due to a genome triplication that occurred ca. 10x106 years ago. We will determine allele-specific expression of FT paralogs from both genomes of a collection of B. napus accessions. The plants will be grown in the field in changing environmental conditions to maximize the chance to detect expression variation of the paralogs. We will compare the contribution of the founder genomes to the regulation of flowering time and asses variation in this contribution. A particular focus will be to study the impact of chromatin-mediated repression on allele selection in B. napus.
Das Projekt "Förderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Entwicklung eines innovativen nachhaltigen Produktionsverfahrens zur Herstellung von Biotensiden in nicht-pathogenen Pseudomonaden (Phase I)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Biologie, Forschungszentrum Jülich, Institut für Molekulare Enzymtechnologie im Forschungszentrum Jülich durchgeführt. Ziel des Gesamtprojektes (Phase 1 und Phase 2) ist die Entwicklung eines nachhaltigen Produktionsverfahrens für Rhamnolipide mit Hilfe eines nicht-pathogenen Bakteriums als Katalysator und umweltschonender Produktaufarbeitung. Dabei zielt das Projekt durch Bündelung der Expertisen beginnend bei der Stammkonstruktion, über die Optimierung von Stämmen und Verfahrenstechniken bis hin zum Scale-Up und der Entwicklung alternativer Produktaufarbeitungstechniken direkt auf einen Transfer von Technologie der akademischen Partner hin zu den Industriepartnern ab. Durch balancierte Expression der relevanten Biosynthese Gene/ Operons aus P. aeruginosa im nicht-pathogenen Stamm P. putida, der sich durch eine hohe Toleranz gegenüber dem Rhamnolipid als Produkt auszeichnet, soll dessen Produktivität gesteigert werden. Hierzu wurde in Kooperation mit der Firma Evocatal ein neues System zur Konstruktion und nachfolgenden Durchmusterung von Bibliotheken synthetischer Promotoren entwickelt. Dieses innovative Promoter-Trap-System basiert auf den neuartigen evoglow Reporterproteinen und wurde bereits genutzt, um eine Promotorbank zu erzeugen, die nunmehr in Kooperation getestet wird. Hierzu wurde die Parallelkultivierung rekombinanter P. putida im BioLector-System erfolgreich etabliert und die Technik genutzt, um die Toleranz der Stämme gegenüber hohen Produkttitern und die Kompatibilität des verwendeten Antibiotikums zu bestätigen. Ferner wurde gezeigt, dass die Schaumbildung keine Limitierung für den Einsatz des Systems darstellt. Somit steht bereits jetzt die notwendige Hochdurchsatzmethodik zur Isolierung geeigneter Promotoren zur Verfügung. Durch Analyse des metabolischen Netzwerks konnte in einem ersten erfolgreichen Schritt das Potential des Stammes für eine metabolische Optimierung gezeigt werden. Hierbei wurde die Rhamnolipidproduktion durch Verwendung einer Mutante des um Vorläufermoleküle konkurrierenden Stoffwechselweges zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) um den Faktor 3,5 gesteigert werden. Ferner wurde eine Entkopplung von Zellwachstum und Rhamnolipidproduktion gezeigt, die eine vereinfachte Optimierung der Leistungsfähigkeit des Wirtsmetabolismus und des genetischen Konstrukts zur Rhamnolipidproduktion erlauben wird. In Up-scaling-Versuchen wurde die rekombinante Produktion von Rhamnolipiden erfolgreich im 50-Liter-Maßstab durchgeführt. Es zeigte sich, dass das gezielte Ausschäumen des Produkts eine Anreicherung um ca. den Faktor 100 erbringen kann, was eine interessante Option zur Verbesserung der Reinigung im Sinne der Umweltfreundlichkeit darstellt. Der Test von Adsorbentien verlief ebenso vielversprechend wie erste Versuche zur Reinigung von Monorhamnolipiden. Die Produktion von Rhamnolipiden war ferner unter Verwendung von Glukose in Mineralmedium möglich. (Text gekürzt)
Das Projekt "Genmanipulation des anaeroben Zymomonas mobilis fuer die Fermentierung von Staerkeabfaellen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forschungszentrum Jülich GmbH durchgeführt. Objective: Zymomonas bacteria could offer considerable potential for improved alcohol fermentation in comparison with yeasts. An efficient expression vector is, however, an absolute requisite to open the possibility of genetically engineered zymomonas. The bacteria could then be made able to use for example renewable carbon substrates abundant in agriculture wastes. General Information: An efficient expression vector shall be constructed for zymomonas mobilis. For this, the promotor of the pyruvate decarboxylase gene will be isolated, sequenced and built into a broad host range plasmid. Genes for the degradation of amylose (from aspergillus awamorii) or xylose (from klebsiella) shall be placed under control of this strong promoter and expression will be tested in suitable escherichia coli strains. Afterwards, these recombinant plasmids shall be introduced into zymomonas mobilis cells and their expression and stability will be assayed. The long range aim is to study the recombinant strains for continuous ethanol production from agricultural waste substrates as starch and hemicellulose (xylose). Achievements: Zymomonas mobilis is a Gram negative anaerobe producing ethanol 5 to 6 times faster than yeast. It can use only glucose, fructose and sucrose as carbon sources. Therefore, applications of Z mobilis at the industrial level require extention of its spectrum of usable carbohydrates. Genetic improvement was approached through formal genetics and genetic engineering. Chemical mutagenesis, transposon mutagenesis, gene transfer by aided conjugation, construction of recombinant expression vectors and transfer into Z mobilis genes responsible for xylose metabolism were established and can now be applied to increase the substrate range of Z mobilis. Recombinant plasmids were constructed by subcloning fragments of native Z mobilis plasmids in known vectors. These were transferred into Z mobilis by aided conjugation and were stably inherited, especially after the loss of native plasmids. Subcloned Z mobilis plasmid sequences were used to construct new expression vectors, which could be transferred into Z mobilis and induce expression of the xylose catabolism genes xylA and xylB. However, the engineered strains could not ferment xylose. Transformation of Z mobilis by plasmid deoxyribonucleic acid (DNA) occurred at low frequencies only when sequences of incoming plasmid were integrated into the host's genome. Transposon mutagenesis was accomplished by conjugal transfer of transposon bearing plasmids from Pseudomonas, as well as Escherichia coli donors to Z mobilis. All Z mobilis strains tested were able to ferment extracts of various fruits, such as apples, oranges, peaches, watermelons, etc.
Das Projekt "Screening and Identification Methods for official control of Banned Antibiotics and Growth promoters in Feedingstuffs (SIMBAG-FEED)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Staatliche Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Augustenberg durchgeführt. SIMBAG-FEED gehört zu dem spezifischen Programm Competitive and Sustainable Growth', Generic Activity Measurements & Testing', Dedicated Call 10/99, Topic II.15, Screening and identification methods for official control of banned antibiotics and growth promoters in feedingstuffs'. Für die amtliche Kontrolle von Futtermitteln sollen Methoden entwickelt werden, mit denen die fünf verbotenen Antibiotika Zinkbacitracin, Avoparcin, Spiramycin, Tylosin, Virginiamycin sowie die toxischen Wachstumsförderer Olaquindox und Carbadox nachgewiesen und identifiziert werden können. Das zentrale technische und wissenschaftliche Ziel des Projekts ist es, adäquate Multimethoden zu entwickeln, zu verbessern und zu validieren, die in eine übergeordnete Kontrollstrategie implementiert werden können und die folgenden Techniken beinhalten: Mikrobiologischer Plattentest, Hochspannungselektrophorese und Dünnschichtchromatographie als Screening-Methoden, HPLC und LC-MS als Bestätigungsmethoden. Das zweite Ziel besteht darin, eine Referenz-Standard-Bank der 7 verbotenen Substanzen aufzubauen, die 10 Jahre bestand haben sollte. Der Arbeitsplan von SIMBAG-FEED besteht aus 8 sog. Workpackages. WP 1 besteht aus dem Management und der Koordination. Fünf parallele Workpackages (WP 2 - 6) konzentrieren sich auf die Entwicklung, Verbesserung und Validierung der 5 Untersuchungstechniken. WP 7 deckt die Standard-Bank ab, und WP 8 die Ringuntersuchungen für die Methodenvalidierung. Im Verlauf der Arbeiten stellte sich heraus, dass der Plattentest als Screening und die LC-MS zur Bestätigung sich am besten eignen und als EU-Methode lanciert werden sollen. Darüber hinaus besteht in der Fachgruppe 6 Futtermittel des VDLUFA (Verband der deutschen LUFAs) die Absicht, den Plattentest als Grundmodul für das generelle Antibiotika-Screening zu übernehmen und weiterzuentwickeln.
Das Projekt "Metabolit-Regulation von Cryptochrom 2 Aktivität und Blühzeitpunkt" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Marburg, Fachgebiet Pflanzenphysiologie und Photobiologie, Arbeitsgruppe Molekulare Pflanzenphysiologie und Photobiologie durchgeführt. Der UV-A/Blaulichtrezeptor Cryptochrom 2 (cry2) spielt eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Blühinduktion. Wichtige Komponenten der Signalleitung von cry2 sind mehrere nah verwandte bHLH Transkriptionsfaktoren (CIB1, CIB2, CIB4, CIB5), die Blaulicht-abhängig an cry2 binden, als Heterodimere an nicht-kanonische E-Box Motive in der Promotorregion des FLOWERING LOCUS T (FT) Gens binden und hierdurch die Expression dieses zentralen Blühgens induzieren. Weiterhin interagiert cry2 im Blaulicht mit SPA-Proteinen und inhibiert damit die Aktivität der E3 Ubiquitin Ligase CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 1 (COP1), die maßgeblich am Abbau des FT-Transkriptionsaktivators CONSTANS (CO) beteiligt ist. Wir haben gezeigt, dass der FAD-Chromophor im signalaktiven Zustand von cry2 in der neutralen Semichinonform vorliegt und die Bildung dieser Form durch Metabolite wie ATP und NADPH verstärkt wird. Gerichte und strukturbasierte Mutagenese von CRY2 lieferte Hinweise darauf, welche Aminosäuren für die Metabolit-Kontrolle erforderlich sind. Diese Information soll genutzt werden, um die Rolle dieser Metabolite bei der photoperiodischen Blühinduktion aufzuklären. Geplant ist hierfür die Expression entsprechender cry2 Allele in planta und die Analyse der generierten Pflanzenlinien hinsichtlich Blühverhalten, FT-Expression und Interaktion mit down-stream Komponenten. Diese Untersuchungen sollen durch in vitro Studien mit rekombinanten Proteinen komplettiert werden. Im Gegensatz zum Wildtyp Allel von cry1 induziert die cry1L407F Mutante gesteigerte Expression von CO und FT sowie frühes Blühen im Kurztag. In vitro Analysen zeigten ein tryptisches Spaltmuster von cry1L407F im Dunkeln, welches dem von Wildtyp cry1 im Blaulicht entspricht. Das geplante Vorhaben soll klären, ob cry1L407F die gleichen Komponenten wie cry2 für die Induktion von FT nutzt. Hierfür sind Analysen der cry1L407F Mutante im cib1/cib2/cib5 Hintergrund sowie Interaktionsstudien mit cry2 Partnern geplant. Direkte Zusammenarbeiten ergeben sich mit den Vorhaben von Christian Jung (Blühkontrolle bei Beta vulgaris) und Markus Schmid (Regulation des Blühzeitpunkts durch Trehalose-6-P).
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