Dieses Projekt hat zum Ziel, die Mechanismen der Resistenz gegen den Echten Mehltau (E. necator) aufzuklären, die am Haupt-QTL Locus Ren3 auf Chromosom 15 von Regent kodiert sind.Zur Sequenzanalyse des Locus müssen vorhandene genomische Teilsequenzen aus der Region weiter assembliert werden. Die resultierenden Contigs sind durch PCR Verfahren zu überprüfen. Das Schließen noch bestehender Lücken durch long range PCR ist anzustreben. Bioinformatorische Analysen (Ermittlung kodierender Bereiche, Datenbankabgleiche) werden in den Sequenzen positionelle Kandidatengene für die Resistenz identifizieren. Diese Kandidatengene werden auf ihre funktionelle Bedeutung hin untersucht. Dazu dienen Genexpressionsanalysen an resistenten und anfälligen Reben im Zusammenhang mit mikroskopischen Beobachtungen der Wirt/Pathogeninteraktion in frühen Stadien der pflanzlichen Abwehr.Vergleichende Diversitätsstudien der Kandidatengene an einem umfangreichen Probensatz resistenter und anfälliger Reben werden Sequenzvarianten und Einzelnukleotidaustausche (single nucleotide polymorphisms, SNPs) aufzeigen. Diese werden durch QTL Analyse und Assoziationsgenetik auf ihre Korrelation mit der Resistenzausprägung hin untersucht, womit zusätzliche Hinweise auf ihre funktionelle Bedeutung erhalten werden. Letztendlich ist ein Modell der erfolgreichen Abwehr bei Regent zu entwickeln. Wichtige Kandidatengene aus diesen Arbeiten sind durch Transformation in anfällige Rebsorten einzuführen und schließlich durch Test der transgenen Reben in ihrer Funktion zu validieren.Mit diesem Projekt und der Erarbeitung der Resistenzmechanismen wird eine Grundlage zur verbesserten züchterischen Nutzung der Resistenzloci in der Kombinationszüchtung für pyramidisierte, nachhaltige Resistenz geschaffen. Eng Merkmals-korrelierende (SNP) Marker werden erarbeitet, die in der Marker-gestützten Züchtung im Hochdurchsatz angewandt werden können.
Das Gesamtziel des Projekts ist die Entwicklung verbesserter Clostridien-Stämme zur Produktion von n-Butanol mit Cellulose als Substrat. In diesem Vorhaben sollen insbesondere Genüberexpressionsstudien mit ausgewählten Clostridium-Stämmen und entsprechende Stammkonstruktionen durchgeführt werden. Diese Studien sollen und a. die Bedeutung von 'single nucleotide point mutations' (SNPs) belegen. Die Manipulation der SNPs kann die Aktivität von Proteinen ändern und damit die Anpassung des Organismus an wechselnde Fermentationsbedingungen und die Erhöhung der Produktion an Butanol ermöglichen Zunächst werden für ausgewählte Clostridium-Stämme Methoden zur Transformation erarbeitet. Anschließend werden in diesen Stämmen spezifische identifizierte Zielgene oder Zieloperons (über)exprimiert. Dazu werden die entsprechenden Gene oder Operons per PCR amplifiziert und in geeignete Vektoren mit geeigneten Replikons kloniert. Unter Anwendung der ACE-Technologie und des Orthogonalen Expressionssystems werden die ausgewählten Gene oder Operons in das Genom ausgewählter Organismen eingebracht und dort (kontrolliert) exprimiert. Die erhaltenen Mutanten werden im Labormaßstab auf ihre Fermentationseigenschaften untersucht.
The production of vaccines in plants bears a frequently discussed risk factor: The containment of potentially bio-hazardous genes. Transgenes transformed to the nucleus can escape to the environment through pollen flow. We can limit the risk of pollen-mediated transgene dissemination in the first line by use of the chloroplast transformation method. The advantages of plastid transformation consist in the precision of the transgene insertion via homologous recombination, in their maternal inheritance, the high transformation predictability, and circumvention of epigenetic effects, as are silencing and methylation. By this approach we determine the potential to synthesize antigen L1 of the Human Papilloma Virus (HPV) for vaccination in tobacco plastids. Vaccines can be delivered as antigens either for peripheral or oral immunization. Transformation of plants with genes carrying selected antigens of the respective pathogen allows producing immunogenic proteins on the field with very high yields. Our goal is the production of an antigen vaccine against Human Papilloma Virus (HPV), which causes cervical cancer prestages in nearly 2 Prozent of all women in Germany. In order to synthesize the antigenic L1 epitope from HPV 16 a chloroplast transformation vector will be constructed, which will contain a synthetic expression cassette: For increased transcription: two different promoters, for enhanced translation it will carry a 5 motif from the T7 phage G10L sequence. Further the L1 gene will be N-terminally fused to the sequence codons of the first 14 amino acids of GFP (green fluorescent protein) which confers an increased translation. On transcriptional level this construct is followed by a selection cassette containing the aadA gene. Regenerating calli carrying these constructs will be selected on a medium containing spectinomycin. Positive transformants will be identified by PCR and Southern analysis. Further Western blot analysis will prove successful expression of the L1 protein. The novel transformants are then tested on correct folding of the LTB-L1 fusion protein: The recombinant protein can be identified with conformation specific antibodies which only bind when L1 proteins formed virus like capsomers. Our further work is aimed to set up an inducible antigen expression system, which is regulated through chemical induction By this work, plant transformants will be shown to be a reasonable alternative for production of vaccines. Due to these results the next step to proof the immunogenicity has the best prospects.
Polyhydroxyfettsäuren (PHF) stellen eine Gruppe von Biopolymeren dar, die von einer Vielzahl von Bakterien als Speicherstoffe gebildet werden. Neben der fermentativen Produktion gibt es die Möglichkeit PHF über gentechnisch modizifizierte Pflanzen zu produzieren. Mit diesem Ziel werden im Rahmen des Verbundvorhabens drei landwirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen bearbeitet, Zuckerrübe, Kartoffel und Raps. Das Ziel des Verbundvorhabens besteht darin, Wege für die Produktion von PHB und anderen ausgewählten PHF in den genannten Nutzpflanzen aufzuzeigen und Protokolle zur Erstellung derartiger Pflanzen auszuarbeiten. Es sollen züchterische Prototypen hergestellt und deren ertragsphysiologische Eigenschaften unter pflanzenbaulichen Gesichtspunkten bestimmt werden. Im Teilvorhaben 5 wird die Kerngenomtransformation von Raps und Zuckerrübe mit Triple-Konstrukten durchgeführt. PHF-synthetisierende Primärtransformanten werden im Gewächshaus vermehrt, um ausreichend Pflanzenmaterial für Arbeiten zur Optimierung der PHF-Extraktion im Technikumsmaßstab bei dem Unterauftragnehmer SÜDZUCKER AG bereitstellen zu können. Für das dritte Projektjahr ist ein Freilandversuch zusammen mit dem Projektpartner Universität Kiel geplant.
Der Sternrusstau ist die wichtigste pilzliche Erkrankung von Rosen im Freiland. In den meisten der gegenwaertigen Zuchtsorten fehlen natuerliche Resistenzquellen gegen diese Krankheiten. Deshalb ist die Verwendung von Rosen im oeffentlichen Gruen stark eingeschraenkt, da dies den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln zur Bekaempfung des Sternrusstaus erforderlich machen wuerde. Mit Hilfe phytopathologischer und genomanalytischer Methoden ist es inzwischen gelungen, Resistenzquellen gegen den Sternrusstau in Rosenwildarten zu lokalisieren. Es soll nun versucht werden, eines der Resistenzgene gegen den Sternrusstau zu markieren, zu isolieren und anschliessend in bisher anfaellige Edelrosen zu transferieren, damit keine Pflanzenschutzmittel mehr zur Bekaempfung des Sternrusstaus bei Freilandrosen eingesetzt werden muessen. Die Isolierung des bisher charakterisierten Resistenzgens gegen den Sternrusstau soll in folgenden Schritten erfolgen: a) Erstellung bzw. Weiterentwicklung einer ABC-Genbibliothek. b) Isolierung von Klonen im Bereich des Resistenzgens durch bereits vorliegende molekulare Marker und anschliessende Lokalisierung des Resistenzgens auf einzelnen BAC-Klonen. c) Transformation des isolierten Gens in Edelrosen.