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Carbon acquisition during pathogenic development of Ustilago maydis and Colletotrichum graminicola

The biotrophic fungus Ustilago maydis infects corn and induces the formation of tumors. In order for the fungus to proliferate in the infected tissue, U. maydis has to redirect the metabolism of the host to the site of infection. We wish to elucidate how this is accomplished. To this end we will perform transcript profiling during the time course of infection for both, the fungus and the maize plant. This will be complemented by metabolome analysis of different tissues during infection as well as by apoplastic fluid analysis. The goals will be to identify the carbon sources taken up by the fungus during biotrophic growth, to identify the transporters required for uptake, determine their specificity and elucidate how these carbon sources are provided by the plant. Fungal mutants affected in discrete stages of pathogenic development will be included in these studies. Likely candidate genes for carbon uptake/supply as well as for redirecting host metabolism will be functionally characterized by generating knockouts in the fungus and by isolating plants carrying mutations in respective genes or by generating transgenic plants expressing RNAi constructs.

Barley compatibility factors pivotal for root colonisation and manipulation of basal defence by Piriformospora indica

This project is aimed at the characterization of the systemic reprogramming in barley, which modulates the compatible interaction with the biotrophic leaf pathogen Blumeria graminis f.sp. hordei upon root infestation with the mutualistic endophyte Piriformospora indica. We have recently shown that the basidiomycete P. indica - upon successful establishment in the roots - reprograms barley to salt stress tolerance, resistance to root diseases and higher yield (Waller et al., 2005). Successful powdery mildew infections in barley leaves are also disturbed by the mutualistic fungus. These processes are associated with a strong change in plant metabolism, especially with a drastic alteration of leaf and root antioxidants. On the basis of these findings we will perform an in-depth analysis of the barley metabolome (B6) and transcriptome (B7) with two specific foci: First, to elucidate the process of establishment of the mutualistic fungus within the barley roots; second, to characterize elements of the systemic response in leaves leading to an interruption or failure of compatibility processes required for successful establishment of biotrophic leaf pathogens like Blumeria. New gene candidates will be pre-selected systematically for their regulatory role in compatibility by means of transiently transformed barley leaves upon Blumeria inoculation. Stable transgenic barley and maize lines (B3) generated with verified gene candidates and genes identified by other projects (A1, A2, B5, B6) will be tested with Blumeria and P. indica. By comparing candidate genes in the different plant - microbe systems, we will identify common regulatory processes, metabolites and metabolic networks implicated in compatibility including those required for successful interactions with mutualistic fungi.

Einfluss eines rekombinanten humanen P450-Systems auf endogene Inhaltsstoffe in transformierten Pflanzen von Nicotiana tabacum L.

Pflanzliche P450-Enzyme besitzen sowohl Aufgaben im Primär- und Sekundärstoffwechsel der Pflanzen als auch in der Metabolisierung von Xenobiotika einschließlich Herbiziden. Da z.B. Mais eine natürliche Resistenz gegenüber dem Triazin-Herbizid Atrazin aufweist, konnten suszeptible Wildpflanzen, die bei Feldanbau neben den Kulturpflanzen aufkommen, durch Anwendung des Herbizids ohne Schädigung der Kulturpflanzen selektiv bekämpft werden (Herbizidselektivität). Kulturpflanzen wie z.B. Tabak und Kartoffel, die keine oder nur eine unzureichende natürliche Resistenz gegenüber einem bestimmten Herbizid besitzen, können durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation mit einem Säuger-P450-Isoenzym (z.B. CYP1A1 oder CYP1A2) Herbizid-resistent werden. Seit einigen Jahren gibt es in dieser Richtung Bestrebungen, P450-transgene Pflanzen herzustellen. Aufgrund der überlappenden, breiten Substratspezifität des jeweils eingebrachten Säuger-P450-Isoenzyms (Ratte, Mensch) wird in den transgenen Pflanzen meist eine multiple Resistenz gegen verschiedene Herbizide mit unterschiedlichen Strukturen und Wirkmechanismen beobachtet. Vor der Vermarktung von transgenen Pflanzen müssen diese in Feldversuchen getestet werden. Dabei wird die Verträglichkeit des Genproduktes, die Eigenschaften der modifizierten Pflanze, die Expressionsstabilität des eingebrachten Fremd-Gens und mögliche ökologische Auswirkungen untersucht. Zusätzlich sollte neben der Substratspezifität des fremden P450-Isoenzyms gegenüber Xenobiotika getestet werden, ob pflanzliche Sekundärmetaboliten als Substrate in Frage kommen. Außerdem sind mögliche Einflüsse auf den normalen Stoffwechsel der Pflanzen von Interesse, die sich auf den Phänotyp der Pflanzen auswirken können. Z.B. wurde bei Cyp2c14-transformierten Tabak-Pflanzen (aus Kaninchen) eine verstärkte Seneszenz beschrieben, die sich in einem verringertem Chlorophyll-Gehalt, einem erhöhten Gehalt an Abbauprodukten der Lipid-Peroxidation und einem Abbauprodukt des Nornicotins und in einer Abnahme des Nicotin-Gehaltes äußerte. Außerdem wuchsen die Pflanzen langsamer und brauchten mehr Zeit zur Bewurzelung. Dies sind Anzeichen dafür, dass das Einbringen eines Fremd-P450-Gens in Tabak über die oxidative Veränderung der Membranlipide oder -sterole und damit über die Veränderung der Membranstruktur, durch einen hormonellen Eingriff durch Umsetzung eines Brassinosteroids oder die Unterdrückung endogener P450-Gene möglicherweise schwerwiegende metabolische Auswirkungen zur Folge haben kann. Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob die Agrobakterien-vermittelte Transformation von Tabak mit der cDNA des humanen CYP1A2 Auswirkungen auf den endogenen Nicotin-Gehalt der Pflanzen zur Folge haben. CYP1A2 gehört dabei neben anderen Isoenzymen im Gegensatz zu den Hauptenzymen CYP2A6, CYP2B6 und CYP2D6 zu den Isoenzymen, die Nicotin nur bei hoher Substratkonzentration umsetzen. Nicotin besitzt dabei als natürliches Insektizid eine wichtige ökol u.s.w.

Towards a Better Sunlight to Biomass Conversion Efficiency in Microalgae (SUNBIOPATH)

SUNBIOPATH - towards a better sunlight to biomass conversion efficiency in microalgae - is an integrated program of research aimed at improving biomass yields and valorisation of biomass for two Chlorophycean photosynthetic microalgae, Chlamydomonas reinhardtii and Dunaliella salina. Biomass yields will be improved at the level of primary processes that occur in the chloroplasts (photochemistry and sunlight capture by the light harvesting complexes) and in the cell (biochemical pathways and signalling mechanisms that influence ATP synthesis). Optimal growth of the engineered microalgae will be determined in photobioreactors, and biomass yields will be tested using a scale up approach in photobioreactors of different sizes (up to 250 L), some of which being designed and built during SUNBIOPATH. Biomethane production will be evaluated. Compared to other biofuels, biomethane is attractive because the yield of biomass to fuel conversion is higher. Valorisation of biomass will also be achieved through the production of biologicals. Significant progress has been made in the development of chloroplast genetic engineering in microalgae such as Chlamydomonas, however the commercial exploitation of this technology still requires additional research. SUNBIOPATH will address the problem of maximising transgenic expression in the chloroplast and will develop a robust system for chloroplast metabolic engineering by developing methodologies such as inducible expression and trans-operon expression. A techno economic analysis will be made to evaluate the feasibility of using these algae for the purposes proposed (biologicals production in the chloroplast and/or biomethane production) taking into account their role in CO2 mitigation.

Activation tagging in aspen using an inducible two component Ac/Ds-enhancer element system

Based on the Ac/Ds two element transposition system from maize an activation tagging approach is suggested for the hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides) line -Esch5-. The proposed approach is based on results obtained from our earlier work on the genetic transfer of the maize transposable element Ac and its functional analysis in hybrid and pure aspen lines. It was shown that the Ac element is active in aspen and reintegrates elsewhere in genomic regions in high frequency. However, a two element transposon tagging system where Ac and Ds are put together in crosses is not feasible in trees due to the in part long vegetative phases. To overcome this barrier, an inducible two element Ac/ATDs element system is suggested to induce activation tagged variants following two independent transformation steps. In combination with a 35S enhancer tetramer and outward facing two CaMV 35S promoter located near both ends of the ATDs element, expression of genes can be elevated which are located adjacent to the new integration site of the element. As selective marker for ATDs transposition, both knocking-out the expression of a phenotypic marker (rolC gene) and a negative selection marker gene (tms) are considered. Thus, the transposition can easily be screened in primary transgenic lines.

Interplay of arbuscular mycorrhizal fungi with transgenic and non-transgenic wheat

Does fungal resistance in transgenic wheat harm beneficials? Some fungi cause devastating diseases; others are beneficial to the plant, facilitating its uptake of nutrients. If plants are genetically engineered to make them resistant to fungal diseases, this resistance could also have a negative impact on so-called beneficials. Background Mildew and other fungal diseases have to be controlled in agriculture with fungicides that harm the environment. To reduce the use of fungicides, plant breeders are attempting to modify the genetic material of crop plants to enhance their resistance to fungi. However, many plants naturally form close relationships (symbioses) with beneficial fungi (mycorrhizas) that play a major role in enabling the plant to absorb minerals such as phosphorus and nitrogen from the soil. Laboratory trials have shown that enhanced resistance to fungi in genetically modified crops can have a negative effect on symbioses with beneficial fungi. Objectives A major field trial with transgenic wheat (cf. Keller project I) will investigate whether these laboratory results can be extrapolated to conditions in the open. The project will study the effect of enhanced resistance to fungi on the colonization, function and diversity of special symbiotic fungi that are found in the roots of wheat plants. Methods The planned trials will use both conventional microscopy and new genetic methods. The colonization of the plants' roots by symbiotic fungi will be determined by identifying the fungal spores under the microscope and by quantifying the fungal DNA. Trials with special nutrient capsules will provide information on the extent to which the function of these fungi changes. The spores will also be studied to determine the diversity of fungi in the plants' roots. Significance In the struggle to achieve sustainable agriculture and promote healthy soils, it is important to accurately assess the extent to which fungal resistance in crop plants can be reconciled with the symbiotic fungi living in their roots. The project will develop a basis for this work.

Untersuchung des horizontalen Gentransfers in die bakterielle Endophytenmikroflora von Forstgehölzen und Abschätzung einer möglichen Ausbreitung transgener DNA in die Umwelt

Im Projekt soll die ökologische Relevanz eines horizontalen Gentransfers innerhalb der endophytischen Mikroflora von Forstgehölzen untersucht und bewertet werden. Hierzu wird in einem Modellsystem mit Pappel-Stecklingen/Jungpflanzen ein Gentransfer über die bakterielle Konjugation in die Endophytenmikroflora induziert. Der Gentransfer erfolgt durch ein rekombinantes Plasmid mit einem geeigneten Reportergen, das in vitro in einen Agrobakterien- und einen endophytischen Bakterienstamm eingebracht wurde. Es wird geprüft, inwieweit sich das rekombinante Plasmid in der Endophytenmikroflora etablieren kann. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Abschätzung des Entlassens des rekombinanten Plasmids aus der Endophytenmikroflora der Pappel in verschiedene Umweltmedien (Boden und zersetztes Pflanzenmaterial).

Transgene Pflanzen-Zellsuspensionskulturen als Modellsystem zur Erforschung der molekularen Mechanismen der Insektizid-Resistenz

Mit der weltweiten Nutzung von Insektiziden stieg die Anzahl an resistenten Insekten-Arten bis 2006 auf etwa 550 Arten an. Selbst bei gezielter Anwendung von Insektiziden - zur Bekämpfung von Schädlingen in der Landwirtschaft zum Schutz der Ernten und zur Bekämpfung von Krankheitsüberträgern - kommen neben Zielorganismen auch Nicht-Zielorganismen in Kontakt mit den Wirkstoffen. Auf diese Weise entwickeln neben Zielorganismen, wie z.B. der Weißen Fliege, auch Nicht-Zielorganismen, wie z.B. die Taufliege Drosophila melanogaster, Resistenzen. Zu den weit verbreiteten Mechanismen, die Resistenzen bei Insekten auslösen, zählen sowohl die enzymatische Detoxifizierung als auch die Zielort-Unempfindlichkeit. Im ersten Fall begründet sich die Resistenz auf der Tatsache, dass das entsprechende Insekt über ein Enzym verfügt, das in der Lage ist, das betreffende Insektizid mit ausreichend hoher Geschwindigkeit zu Metaboliten umzusetzen, die eine geringere insektizide Wirkung aufweisen. Auf genetischer Ebene bedeutet das, (...) Das Projekt beschäftigt sich mit der P450-Monooxygenase CYP6G1 aus der Taufliege Drosophila melanogaster. Aus genetischen Studien ist bekannt, dass das Cyp6g1-Gen in resistenten Drosophila-Stämmen überexprimiert wird. Eine künstliche Überexpression von Cyp6g1 in Fliegen eines suszeptiblen Drosophila-Stamms führte zur Insektizid-Resistenz. Es wird vermutet, dass das CYP6G1-Enzym die Resistenz des Insekts bewirkt, indem bestimmte Insektizide, wie z.B. Imidacloprid und DDT, durch Metabolisierung detoxifiziert werden. Diese Hypothese soll im Projekt geprüft werden. P450-transgene Tabak-Zellsuspensionskulturen haben sich in unserer Arbeitsgruppe als geeignete in vivo-Systeme zur Untersuchung der Metabolismuskapazität von P450-Enzymen erwiesen. Der gleiche Ansatz wird beim CYP6G1 aus Drosophila melanogaster verfolgt. Im ersten Schritt werden Tabak-Zellsuspensionskulturen mit der cDNA-Sequenz des Cyp6g1 stabil transformiert. Mit den Cyp6g1-transgenen und den unmodifizierten Tabak-Kulturen werden nachfolgend Metabolismusexperimente durchgeführt, wobei z.B. Imidacloprid oder DDT (jeweils in 14C-markierter Form) eingesetzt werden. Durch Vergleich der nicht-transgenen mit der transgenen Tabak-Zellsuspensionskultur kann dann auf die Metabolismusaktivität des CYP6G1-Enzyms bezüglich des eingesetzten Insektizids geschlossen werden. Wichtige Metaboliten können identifiziert und isoliert werden. Der Nachweis, dass das heterolog exprimierte CYP6G1-Enzym das entsprechende Insektizid zu Verbindungen umsetzt, die keine insektizide Wirkung mehr zeigen, stellt dann das letzte Glied in der Beweiskette zur Ursache dieser Insektizid-Resistenz in Drosophila melanogaster dar. Die Prozedur ist analog auf andere Resistenz-Gene (Metabolismus-bedingt) anwendbar. Die resultierenden Erkenntnisse können im günstigen Fall genutzt werden, um (neue) Insektizide zu finden, die vom Resistenzmechanismus unberührt bleiben und deshalb der bestehenden Resistenz entgegenwirken.

Erzeugung transgener Gehölze und Sicherheitsforschung unter besonderer Berücksichtigung der Endophytenproblematik - Literaturstudie

Ziel des Projektes ist die Erstellung einer Literaturübersicht zum Stand der Entwicklung transgener Gehölze und zu den Möglichkeiten (Risikopotential) eines horizontalen Gentransfers in Forstgehölzen. Bei der Erzeugung transgener Gehölze werden binäre Vektoren verwendet, die aus den natürlichen Ti-Plasmiden von Agrobakterien entwickelt wurden. Mit Hilfe dieser Vektorsysteme wird die zu übertragende rekombinante DNA in die Pflanzenzellen eingeschleust. Daneben kann die DNA über bakteriellen Gentransfer auch in andere Bakterien übertragen werden. Durch das Vorhandensein endophytischer Bakterien in Bäumen und die relativ lange Persistenz der Agrobakterien in transformierten Gehölzen besteht somit ein Risiko des horizontalen Gentransfers, das bisher kaum beschrieben wurde. In der Studie wird der Kenntnisstand zum Vorkommen von Endophyten in Forstgehölzen, zur Persistenz von Agrobakterien sowie zu den Mechanismen des bakteriellen Gentransfers dokumentiert. In Verbindung mit den Eigenschaften der verwendeten Vektoren werden hieraus prinzipielle Möglichkeiten für den Gentransfer in die Endophytenflora beschrieben und Schlussfolgerungen für den Forschungsbedarf abgeleitet.

Begleitende Sicherheitsforschung zur Freisetzung gentechnisch veraenderter Petunien

Gentechnisch veraenderte Pflanzen enthalten haeufig als Selektionsmarke das Antibiotika-Resistenz-Gen Neomycin-Phospho-Transferase (NPTII) in ihrem Erbgut. Die Kultivierung solcher Pflanzen im Freiland wirft die Frage auf, ob das NPTII-Gen wieder in Bakterien zurueckgelangen kann. Bei den zu unterscheidenden Pflanzen handelt es sich um Tabak oder Petunien, die mit unterschiedlich modifizierten NPTII-Genen transformiert worden sind. Es soll ueberprueft werden, ob durch die Verrottung dieser Pflanzen das NPTII-Gen in die Erde gelangen und dort von Bodenbakterien aufgenommen und weitervererbt werden kann. Zum Nachweis eines solchen etwaigen horizontalen Gentransfers wird eine hochempfindliche und spezifische Nachweismethode ('Polymerase-Chain-Reaction') eingesetzt. Die Untersuchungen zum Gentransfer werden sowohl im Gewaechshaus (Tabak und Petunie) als auch im Freiland (Petunie) durchgefuehrt. Dabei sollen Erkenntnisse gesammelt werden, inwieweit Gentransferereignisse im Freiland durch analoge Versuche im Gewaechshaus vorhergesagt werden koennen.

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