Aktuelle Publikationen und Tagungen zum Thema Biomonitoring belegen, dass die Anwendung molekularer Biomarker in Biotaproben zur Identifikation von Umwelteinflüssen auf genetischer Ebene immer mehr an Bedeutung zunimmt. Das Ziel dieser Studie war es daher zu überprüfen, ob die Verwendung von Biomarkern auf genetischer Ebene in Jahreshomogenatproben der Umweltprobenbank (UPB) des Bundes prinzipiell ebenfalls möglich ist. Im Rahmen dieser Machbarkeitsstudie wurden Untersuchungen mit archivierten Muskulatur- und Leberproben von Brassen (Abramis brama) durchgeführt, da diese zum einen im UPB-Programm schon langjährig beprobt werden. Zum anderen sind Fische in der aquatischen Umwelt einer Vielzahl von Schadstoffen ausgesetzt, so dass sich hier viele potentielle Anwendungen ergeben. Weiterhin liegen für Fische umfangreiche Daten aus genetischen Untersuchungen im Labor vor. So ist es durch die Ableitung aus den bekannten Gensequenzen des Zebrabärblings (Danio rerio), einer mit dem Brassen verwandten Spezies, gelungen, Gene zu identifizieren, die im Brassen durch unterschiedliche Stressoren reguliert werden. Es konnten sowohl Marker detektiert werden, die wirkstoff-unspezifisch reguliert werden, als auch solche, die als wirkstoff-spezifisch anzusehen sind. Als Wirkstoff-unspezifischer Marker konnte das Gen des so genannten Hitzeschockproteins (HSP; heat shock protein) identifiziert werden. HSP wird durch die unterschiedlichsten Stressoren sehr schnell reguliert und repräsentiert dahingehend einen Indikator, der Auskunft darüber gibt, in welchem allgemeinen Stresszustand sich der untersuchte Organismus befand. Als Wirkstoffspezifische Marker wurden die Gene des Metallothioneins, das durch verschiedene Schwermetalle, und des Vitellogenins, das durch östrogenwirksame Substanzen in der Expression stark beeinflusst werden, gewählt. Für diese Gene konnte in Brassenlebern eine von den Expositionsbedingungen abhängige Aktivität nachgewiesen werden. So zeigten Fische von belasteten Standorten im Vergleich zu einem Referenzstandort eine höhere Expression dieser Gene. Die vorliegende Studie zeigt damit prinzipiell, dass molekulare Biomarker auch in Brassenproben der Umweltprobenbank des Bundes im Sinne eines retrospektiven Monitoring erfolgreich Anwendung finden können. Mit Hilfe der DNA-Microarray Technik wird es nun möglich, entsprechende Untersuchungen auf eine Vielzahl relevanter Gene auszuweiten und an einer großen Probenzahl durchzuführen. Damit könnten die bisher schon erfolgreich durchgeführten retrospektiven Untersuchungen von UPB-Proben zur Exposition von Fischen gegenüber Schadstoffen mit Daten zu möglichen Effekten auf genetischer Ebene ergänzt werden. Da Biomarker geschlechtsspezifisch unterschiedlich reagieren können (z.B. Vitellogenin), wird empfohlen, insbesondere die Brassen für die UPB zukünftig nach Geschlechtern getrennt zu beproben und einzulagern, um so die Anwendungsmöglichkeiten noch zu erweitern.
In dem Projekt soll geprüft werden, ob sich der Embryotest mit dem Zebrabärbling (Danio rerio) als Screeningtest zur Erfassung des teratogenen Potentials von Chemikalien für Säugetiere eignet. Für die Fragestellung mußte der Embryotest, der als Ersatzmethode für den akuten Fischtest entwickelt wurde, modifiziert werden. Es wurden folgende sechs Endpunkte für teratogene Effekte festgelegt: keine Anlage der Augen, Deformation der Wirbelsäule, Deformation des Schwanzes, Deformation der Kopfanlage, keine Anlage der Otolithen und Reduktion der Schwanzlänge. Es wurden zahlreiche Substanzen untersucht. Dazu zählen Chemikalien, die beim Säuger eindeutig teratogene Effekte verursachen und nicht teratogene Substanzen. Die erzielten Ergebnisse sind vielversprechend und deuten darauf hin, daß sich dieses Modell zur Erkennung eines säugerteratogenen Potentials von Chemikalien eignet.
Ziel des Vorhabens ist es, einen Ein-Generationen Reproduktionstest mit Zebrafischen (ZEOGRT) zu entwickeln, der als OECD-Prüfrichtline eingereicht werden kann. Für die Bewertung der von chemischen Stoffen ausgehenden Gefahren und Risiken für die aquatische Umwelt sind die Wirkungen von chemischen Substanzen auf Vertebraten (Fische), Invertebraten (Krebstiere) und Primärproduzenten (Algen) mittels standardisierter Prüfmethoden zu untersuchen. Bisher gibt es jedoch keinen international standardisierten längerfristigen Fischtest mit Zebrabärblingen, der alle Lebensphasen umfasst. Für die Durchführung von Prüfungen auf längerfristige Effekte (Reproduktion, endokrine Effekte) wird in den verschiedenen Stoffregelungen (z.B. REACH Anhang 10, PflSchG, AMG) bisher das OECD 'Detailed Review Paper (DRP) on Fish Life-Cycle Tests' (OECD 'Series on Testing and Assessment No. 95') herangezogen. Daten aus Tests nach dem DRP fallen nicht unter die gegenseitige Anerkennung von Daten innerhalb der OECD (mutual acceptance of date - MAD). Dadurch kann es zu Doppeltestungen der gleichen chemischen Substanz kommen. Das bedeutet negative Auswirkungen mit Blick auf den Tierschutz (größer als 1000 Tiere pro Test) und Kosten (größer als 150 T Euro). Der zu entwickelnde und für die Bewertung von Endokrinen Disruptoren dringend benötigte OECD ZEOGRT wird unter MAD fallen, so dass die genannten Risiken entfallen. Die Standardisierung von OECD Prüfrichtlinien erfolgt nach den Prinzipien des OECD 'Guidance Document on the Validation and International Acceptance of new or updated Test Methods for Hazard Assessment' (OECD 'Series on Testing and Assessment No. 34'). Danach ist die Durchführung einer Validierungsstudie nötig. In diesem Vorhaben wird die Validierungsstudie für den ZEOGRT entsprechend des OECD Guidance Document No. 34 durchgeführt.
a) Endokrin wirksame Substanzen sind zu identifizieren und entsprechend zu regulieren. Etablierte Methoden, um Effekte auf Umweltorganismen und Populationen zu identifizieren, beschränken sich hauptsächlich auf chronische Studien mit Fischen. Aussagekräftige Ergebnisse erhält man mit diesen Studien jedoch erst nach mehreren Monaten. Direkt nach der Aufnahme einer endokrin wirksamen Substanz in den Organismus können spezifische Gene als Folge der endokrinen Störung aktiviert oder deaktiviert werden. Diese Veränderung kann mit der Methode der Genexpressionsanalyse bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt, beispielsweise nach 48 h, gemessen werden. In einem bereits abgeschlossenen Vorhaben (FKZ-371263418) wurde die prinzipielle Umsetzung und Eignung der Kombination des zusätzlichen Endpunktes Genexpressionsanalyse innerhalb eines verlängerten Fischtestes erfolgreich erarbeitet. Im Forschungsvorhaben sollen diese Erkenntnisse innerhalb eines Mehrgenerationenfischtests weiter ausgebaut werden. Dabei sollen, mit erheblich reduziertem Aufwand, zusätzliche Probennahmen in ein laufendes Forschungsvorhaben (Validierungsstudien zum Reproduktionstest mit Zebrafischen, FKZ 3716 65 4180) integriert werden. Die Genexpression ausgewählter Gene, die in entsprechende endokrine Prozesse involviert sind, soll in Fischen der F1- sowie F2-Generation analysiert werden. b) Durch die Integration des zusätzlichen frühen Endpunktes Genexpressionsanalyse soll die Aussagekraft bereits bestehender Testverfahren für endokrine wirksame Substanzen in Fischen erhöht werden. So können bereits zu früheren Zeitpunkten Toxizitätsmechanismen analysiert und ein endokriner Verdacht gestärkt werden. Die Ergebnisse sind Teil der Entwicklung neuer Testmethoden und Bewertungskonzepte für die Regulation von Chemikalien.