Cydia pomonella granulovirus (CpGV, Baculoviridae) is one of the most important agents for the control of codling moth (CM, Cydia pomonella, L.) in both biological and integrated pest management. The rapid emergence of resistance against CpGV-M, which was observed in about 40 European CM field populations from 2003 on, could be traced back to a single, dominant, sex-linked gene. Since then, resistance management has been based on mixtures of new CpGV isolates (CpGV-I12, -S), which are able to overcome this resistance. Recently, resistance even to these novel isolates was observed in CM field populations. This resistance does not follow the described dominant, sex-linked inheritance trait. At the same time, another isolate CpGV-V15 was identified showing high virulence against these resistant populations. To elucidate this novel resistance mechanism and to identify the resistance gene(s) involved, we propose a comprehensive analysis of this resistance on the cellular and genomic level of codling moth. Because of the lack of previous knowledge of the molecular mechanisms of virus resistance in insects, several different and complementary approaches will be pursued. This study will not only give an in-depth insight into the genetic possibilities for development of baculovirus resistance in CM field populations and how the virus overcomes it, but can also serve as an important model for other baculovirus-host interaction systems.
Die Larven des Apfelwicklers (Cydia pomonella, Familie Tortricidae) bohren sich in unreife Äpfel und vollenden dort ihre Larvalentwicklung. Dieser Fruchtbefall führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Verschiedene Isolate des Cydia pomonella granulovirus (CpGV), spielen im Obstbau als kommerzielle Pflanzenschutzmittel eine bedeutende Rolle und werden sowohl im ökologischen wie im konventionellen Apfelanbau verwendet. Eine Resistenz des Apfelwicklers gegen CpGV wurde bisher in sieben Ländern Europas und im US-Bundesstaat Washington (USA) bestätigt, wobei drei verschiedene Resistenztypen (I-III) gefunden wurden. Der Resistenztyp I ist in Europa am weitesten verbreitet und ist gegen das virale Gen pe38 gerichtet. CpGV-Isolate, die ein pe38-Gen ohne eine 2×12 bp Wiederholungssequenz besitzen, sind in der Lage, den Resistenztyp I zu brechen. Dieser Befund war die Grundlage zur Entwicklung resistenzbrechender CpGV-Produkte und der Weiterentwicklung von Resistenzmanagementstrategien. Im Fokus des vorliegenden Projekts steht die Aufklärung der Funktion des pe38 und der frühen Ereignisse im CpGV-Infektionsprozess beim Apfelwickler. Vorarbeiten haben gezeigt, dass das pe38-Expressionsniveau im CpGV-Infektionsprozess von Apfelwicklerlarven und bei Apfelwicklerzellkulturen (CM-Cp14R-Zelllinie) eher niedrig ist. Dies macht es schwierig, PE38 und dessen potentiellen Interaktionspartner zu isolieren und zu identifizieren. Um diese Einschränkung zu umgehen und die Rolle von pe38 bei der CpGV-Infektion und im Resistenzprozess von CM-Larven zu untersuchen, sollen Cp14R-pe38-Zelllinien, die PE38 konstitutiv exprimieren, stabil transformiert werden. Hierdurch sollen die Funktion von PE38 und dessen Protein- bzw. DNA-Interaktionspartner untersucht werden. Mittels Pull-Down-Experimenten und anschließenden LC-MS/MS-Analysen und Illumina-Sequenzierungen sollen die Aminosäureabschnitte bzw., Nukleinsäuresequenzen bestimmt werden, die als zelluläre Interaktionspartner von PE38 fungieren. Mittels der verfügbaren Genomsequenzen des Apfelwicklers und des CpGV-M können dann die dazugehörigen Wirts- bzw. Virusgene identifiziert werden. Eine intrazelluläre Lokalisierung des PE38 während der Infektion soll mittels konfokaler Mikroskopie verfolgt werden, um die dessen Funktion näher zu beschreiben, Die Transkription ausgewählter viraler Gene wird quantifiziert, um den Einfluss verschiedener Ursprünge von PE38 auf die die Virusreplikation und -vermehrung bei CpGV-Infektionen zu bestimmen.Das Projekt soll somit die Frage klären, welche Rolle pe38 bei der Infektion des Wirtsinsektes spielt und wie es resistenten Apfelwicklern gelingt, die CpGV-Replikation im Frühstadium der Infektion zu blockieren Die Aufklärung der Funktion des pe38 ermöglicht nicht nur den molekularen Mechanismus der CpGV-Resistenz zu verstehen, sondern auch neue Wege zu einer nachhaltigen Anwendung von Baculoviren als biologische Pflanzenschutzmittel aufzeigen.
Zur biologischen Bekaempfung von schwer oder nicht mit Bacillus thuringiensis zu bekaempfenden Insekten bietet sich der Einsatz von insektenpathogenen Viren an. Baculoviren stellen hierfuer geeignete Agentien mit engem Wirtsspektrum dar. Sie greifen nur bestimmte (schaedliche) Zielinsekten an und schonen ausser Nutzarthropoden (Biene, Entomophagen) auch Umwelt, Vieh und Mensch. Ziel des Verfahrens: Bereitstellung von im Freiland gegen Schadinsekten einsetzbare Viruspraeparate.
1. Vorhabenziel Im Rahmen des Vorhabens sollen Methoden entwickelt und molekulare Analysen durchgeführt werden, welche für die Entwicklung und Produktion eines umweltfreundlichen, biologischen - auf Baculoviren beruhenden - Pflanzenschutzverfahren zur Bekämpfung von Erdeulen-raupen der Gattung Agrotis notwendig sind. Damit sollen die wissenschaftlichen Grundlagen für eine optimierte Produktion dieser hoch selektiven Insektenviren, die sich hervorragend zur biologischen Bekämpfung von Schadlepidopteren eignen, erarbeitet werden. 2. Arbeitsplanung Die Forschungs- und Entwicklungsaufgaben umfassen 1) die Entwicklung von standardisierter Bioassay-Methoden, die die Bestimmung der biologischen Aktivität Agrotis-spezifischer Baculoviren ermöglichen. Diese werden dem KMU-Partner übergeben, 2) die Bestimmung der Virulenzparameter Agrotis-spezifischer Baculoviren in verschiedenen Agrotis-Arten, 3) molekulare Charakterisierung verschiedener Produktionslinien von Agrotis-Baculoviren des KMU-Partners hinsichtlich ihrer Identität mittels DNA-Restriktionsanalyse und Genomsequenzierung, 4) Analyse der genetischen Stabilität der Viren nach Wirtspassagen mittels DNA-Restriktionsanalyse und Genomsequenzierung, 5) Testung der Produktivität verschiedener Wirtsarten und Zellkultursysteme in Bezug auf die Stabilität und Infektiösität der Viren.
Baculoviren (Fam. Baculoviridae) sind die größte und ökologisch bedeutendste Gruppe insektenspezifischer DNA-Viren, die ein beträchtliches ökonomisches Potential als Expressionssystem und als hoch selektive Bioinsektizide vorweisen. Trotz ihrer Bedeutung ist nur Bruchteil der über 600 bisher identifizierten Baculoviren-Arten näher charakterisiert. Der derzeitige Stand ihrer Klassifikation ist unzureichend, da für sie kein natürliches taxonomisches System existiert. Die Verwendung des Wirtsinsektes als Kriterium der Art-Einteilung hat bei Baculoviren mit oligo- oder polyspezifischem Wirtsbereich in erheblichem Umfang zu Mehrfachbenennungen einzelner Virusarten geführt.Im vorliegenden Projekt soll durch die Genomsequenzierung des Cryptophlebia leucotreta Granulovirus als Modell für ein torticiden-spezifisches Granulovirus und dem phylogenetischen Vergleich aller bisher bekannten Baculovirengene ein natürliches Klassifikationssystem entwickelt werden, das die evolutionäre Verwandtschaft einzelner Baculoviren widerspiegelt. Durch die Entwicklung einer PCR-gestützten Genamplifikation und -analyse soll neben dem Klassifikationssystem eine verläßliche und effiziente molekulare Nachweismethode etabliert und validiert werden, die eine einfache Identifikation und Klassifizierung neuer Baculoviren-Isolate erlaubt.
Der natürliche Transfer der Insektentransposons TCp3.2 und TCI4.7 in das Genom des Baculovirus CpGV ist ein einmaliges genetisches Modell für den horizontalen Genfluß zwischen verschiedenen Arten. Im vorliegenden Projekt werden die molekularen und zellulären Mechanismen dieses Transfers untersucht. Im Rahmen einer einjährigen Verlängerung sollen vergleichende Transkriptions- und Expressionsanalysen der Transposasegene von TCp3.2 und TCI4.7 in virusinfizierten und nicht infizierten Insektenlarven bzw. -zellen abgeschlossen werden. Durch diese Untersuchungen soll festgestellt werden, ob die CpGV-Infektion Einfluß auf die Genaktivität von TCp3.2 bzw. TCI4.7 im Insektengenom hat. Da die Ergebnisse aus dem bisherigen Projekt gezeigt haben, daß die transposon-tragenden CpGV-Mutanten einen Selektionsnachteil gegenüber wildtyp-CpGV haben, soll durch eine vergleichende Transkriptionsanalyse der Transposoninsertionsorte der funktionale Einfluß der Transposonintegration af die genetische Integrität von CpGV untersucht werden.
Ueber die biologischen Eigenschaften der fuer eine Verwendung im Pflanzenschutz vorgesehenen Baculoviren ist schon viel bekannt. In der Regel handelt es sich dabei aber immer um Viren die in vivo, d.h. in lebenden Wirtslarven produziert wurden. Eigenschaften wie biologische Aktivitaet, UV-Persistenz, Stabilitaet im Boden und auf dem Blatt werden in diesem Projekt vergleichend auch fuer Baculoviren, die in vitro, d.h. in Zellkulturen hergestellt wurden, untersucht. Als Modellviren dienen das Kernpolyedervirus von Helicoverpa amigera (HaSNPV) und von Spodoptera exigua (SeMNPV).
Die Produktionsvolumina zur Vermehrung der Insektenzellen und Baculoviren sollen von z.Z. 10 Litern auf 50-100 Liter erhoeht werden. Hierzu wird die Technologie in Ansaetzen von 10 Litern detailliert erarbeitet werden. Die von uns entwickelten serumfreien Kulturmedien werden weiter verbessert. Hierdurch soll eine weitere Verbilligung der Produktion sowie eine Verbesserung der Virusausbeute erzielt werden.
Der Bekreuzte Traubenwickler (Lobesia botrana Schiff) ist in den vergangenen Jahren zu einem Hauptschaedling im Weinbau geworden. Dieser Schaedling tritt heute in allen Weinbaugebieten Deutschlands auf. Fuer eine umweltfreundliche, sichere und nachhaltige Kontrolle des Traubenwicklers ist eine Fortentwicklung bisheriger Bekaempfungsstragegien notwendig. Hierbei koennen Insektenviren eine hervorragende Rolle spielen. Baculoviren sind eine Gruppe von hoch selektiven Insektenpathogenen, die seit vielen Jahren mit grossem Erfolg in der biologischen Schaedlingsbekaempfung eingesetzt werden. Die Attraktivitaet von Baculoviren fuer die Schaedlingskontrolle liegt in ihrer hohen Effizienz, ihrer beispiellosen Selektivitaet und ihrer voelligen Unbedenklichkeit fuer Pflanze, Tier und Menschen. Damit werden Baculoviren zu einer idealen Komponente des integrierten Pflanzenschutzes. In den vergangenen 15 Jahren wurden die wissenschaftlichen Grundlagen erarbeitet, die Insektizideigenschaften von Baculoviren durch gentechnische Veraenderung noch zu verbessern. Das Ziel des vorliegenden Projektes ist die Entwicklung einer neuartigen biotechnologischen Kontrollmoeglichkeit des Bekreuzten Traubenwicklers mittels eines Baculoviren-Insektizides. Hierzu soll untersucht werden, welche Baculovirenisolate infektioes fuer L botrana sind und in welchem Masse diese fuer die Entwicklung eines Baculovirus-Insektizids geeignet sind. Diese Viren werden dann biologisch und molekular naeher charakterisiert werden.
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