This research project will attempt to characterize useful elements for the biological elimination of chloro- and nitrotoluenes and to identify bottlenecks which prevent the degradation for the recalcitrant compounds, followed by a selective manipulation of key genes to overcome the bottlenecks. The optimization will give rise to a set of catabolic segments which can be rationally combined to develop biocatalysts with new degradative capabilities and optimized performance. Analysis of biocatalyst performance and results of validation experiments will lead to further optimization procedures. The strategy will be applied to develop biocatalysts for predictable degradation of 2- and 3-nitro-, 2-chloro- as well as dichlorotoluenes, to the optimization of performance of 4-nitrotoluene degraders and to the assessment of this strategy for a variety of analogous compounds using the catabolic elements. The catabolic elements evolved in this project will be eventually used as a basis to improve further biocatalysts and the variety of tools developed in this project will be of general applicability in the generation of predictable biocatalysts. The overall project is broken down into three different work packages: 1) analysis of catabolic segments, the assessment of their usefulness for optimization procedures and the identification of critical steps. 2) the improvement and eventual optimization of isolated catabolic elements, and 3) testing the efficacy of the new biodegraders.
SynRg bearbeitet in einem interdisziplinären Ansatz die Optimierung von Wertstoffsynthese, Syntheseort und Weiterverarbeitung für die Nutzung von Pflanzenrohstoffen in Chemie und Energieerzeugung. Die Teile 'Produkte und Anwendungen' nutzen chemische Funktionalisierungen, um Polymereigenschaften gezielt auf ihre Anwendungen hin zu modifizieren, und führen zu biomasse-basierte, anwendungsnahe Produkte. Das langfristige Ziel besteht in der Umstellung der Produktion von Spezialpolymeren auf eine nachhaltige Basis aus nachwachsenden Rohstoffen, um die bisher eingesetzte petrochemischen Routen ersetzen zu können. Die von den Partnern bereitgestellten Zwischenprodukte werden chemisch funktionalisiert. Die entstehenden Monomere werden charakterisiert und die Methode der Funktionalisierung wird hinsichtlich Selektivität und Umsatz optimiert. Weitere Methoden der Funktionalisierung kommen zum Einsatz und die Reaktionen werden analog zur ersten Route für die Zielprodukte optimiert. Die funktionalisierten Produkte werden zu Basispolymeren und Compounds umgesetzt. Ein Vergleich der chemischen und der biotechnologischen Routen wird durchgeführt. Dabei werden die von den Partnern entwickelten Biokatalysatoren hinsichtlich ihres Potentials mit den chemischen Verfahren verglichen. In diesem Vergleich sollen die Aussagen zur Selektivität, Umsatz, Wirtschaftlichkeit der biotechnologischen Route im Vordergrund stehen. Die Ergebnisse des Verbundvorhabens sollen genutzt werden, um alternative biotechnologische Routen im Vergleich zu den bestehenden petrochemischen Verfahren zu bewerten und im Falle der Wirtschaftlichkeit der Prozesse und vergleichbarer Produktqualität zu kommerzialisieren. Im Erfolgsfall würden sich die Planung und der Aufbau einer Pilotanlage anschließen, um Erfahrungen beim Scale-up der Verfahren zu sammeln. In einem nächsten Schritt würde sich ein Investitionsprojekt für eine Produktionsanlage zur Bereitstellung größerer Produktmengen anschließen.
SynRg beabsichtigt einen interdisziplinären Ansatz zur Optimierung von Wertstoffsynthese, Syntheseort und Weiterverarbeitung für die Nutzung von Pflanzenrohstoffen in Chemie und Energieerzeugung zu starten. Die gesamte Wertschöpfungskette für die Umstellung von petrochemischen auf pflanzliche Grundstoffe soll am Beispiel der Polymere unter dem Aspekt der nachhaltigen Produktion von Wertstoffen aus NaWaRo unter Berücksichtigung der Stoffstromverteilung in Pflanzen in interdisziplinärer Zusammenarbeit untersucht und modifiziert werden, um so neue und innovative Methoden und Verfahren zur Wertstoffgewinnung zu ermitteln. Neben der Koordination und Erstellung des Tools zur Projektsteuerung und Analyse der Wertschöpfungskette (ePlan), hilft PHY bei der Identifizierung von Faktoren zur Kontrolle der Organbildung und des Blühzeitpunktes. Es werden Faktoren gesucht, die bei der Kontrolle des Stammzellschicksals, der Zellteilungsaktivitäten im Meristem, sowie den Wechsel von generativer zu reproduktiver Phase wirken, u.a. auch Regenerationsfaktoren. Eine weitere Aufgabe ist die Klonierung von Genen pflanzl. Biokatalysatoren zur Enzymproduktion in Mikroorganismen. Dies dient hauptsächlich der Rohstoffadaptierten Enzymentwicklung für die Umwandlung von Fetten in Fettsäuren und zu Dicarbonsäuren. Die Aktivitätsbestimmung der Biokatalysatoren ist ein wichtiger Bestandteil unserer Arbeit. PHY adressiert den großen Wachstumsmarkt der Enzyme und nachhaltigen Produktionsprozessen. PHY nutzt bereits ihr Know-how der Pflanzenbiodiversität um Pflanzen als Enzym- und Rohstoffquelle zu verwenden. Da der Bedarf steigt, klassische Chemieproduktion durch nachhaltige zu ersetzten, sind die wirtschaftlichen Erfolgsaussichten für die Vermarktung der zu isolierenden pflanzlichen Biokatalysatoren als sehr gut einzustufen. Das Steuerungstool ePlan wird für die Steuerung komplexer Vorgänge vermarktet werden können.
Das hiermit beantragte Projekt hat die biotechnologische Umsetzung von nachwachsenden Rohstoffen zu einem Monomer zum Ziel, welche dann auf chemischem Wege polymerisiert wird. Die Polymerisation ist nicht Bestandteil dieses Projektes. Gegenstand der Resourcenplanung sind die Auswahl und Optimierung eines geeigneten Biokatalysators, die Optimierung seiner Produktion und die Prozessentwicklung für die eigentliche Biotransformation, sowie die Entwicklung der Extraktion und Reinigung des Monomers. Die anvisierten Endprodukte werden aktuell ausschließlich aus petrochemischen Grundstoffen in einem Volumen von mehreren zehntausend Tonnen/a produziert. Der Markt für diese Produkte ist also bereits vorhanden und entwickelt. Die basierend auf petrochemischen Rohstoffen hergestellten Monomere sind qualitativ nicht von den auf Basis nachwachsender Rohstoffe hergestellten Monomeren zu unterscheiden. Daher besteht großes Interesse die Monomer-Produktion bei Erreichen der Ziele bezüglich Effizienz und Kosten vollständig auf eine nachhaltige Basis aus nachwachsenden Rohstoffen umzustellen.
Thema des geplanten Projektes sind Untersuchungen zum Ersatz von Duroplasten durch enzymatisch quervernetzte Proteine. Duroplaste werden als Bindemittel u. a. im Formsandbau und zur Herstellung von Holzspanplatten eingesetzt. Derartige Bindemittel bestehen bisher z. B. aus Melamin-Formaldehyd-Phenolharzen. Im Verlauf des Projektes soll das Potential von enzymatisch quervernetzten Proteinen untersucht werden, die bisher verwendeten Bindemittel zu ersetzen. Zur Quervernetzung soll die Transglutaminase-Technologie verwendet werden und außerdem der Biokatalysator weiterentwickelt werden, der bereits für die Herstellung von Folien auf Proteinbasis verwendet wird. Das Projekt gliedert sich in zwei Arbeitspakete: 1.: Untersuchungen zur Eignung von enzymatisch quervernetzten Proteinen als Bindemittel und 2.: Verbesserung von Transglutaminasen und Bereitstellung der Enzyme. Es wird erwartet, dass bei positivem Verlauf des Projektes ein Teil dieser Kunstharze durch enzymatisch quervernetzte Proteine ersetzt werden kann.
Das Ziel des Projekts ist die stoffliche Nutzung nachwachsender einheimischer Rohstoffe für die Produktion des mikrobiellen Intermediats 3-Hydroxypropionaldehyd, das unter anderem chemisch zu Acrylsäure umgesetzt werden kann. Dies beinhaltete die Entwicklung eines Ganzzellbiokatalysators, der den Rohstoff Glycerin biokatalytisch in das Zielprodukt 3-Hydroxypropionaldehyd umwandelt. Anschließend wurde der Einsatz des Ganzzellbiokatalysators durch Metabolic Engineering und durch Anpassung der Prozessbedingungen optimiert. Des Weiteren wurden Anwendungstests bezüglich der direkten Verwendung von 3-Hydroxypropionaldehyd in alternativen Marktsegmenten durchgeführt.
Das Projektziel umfasste die Entwicklung eines umweltfreundlichen elektroenzymatischen Verfahrens zur Herstellung verschiedener chiraler Epoxide und Ketone mit hoher Enantiomerenreinheit mittels kofaktorabhängigen Biokatalysatoren. Um dieses Ziel zu realisieren, sollten bekannte Katalysatoren möglichste einfach hergestellt werden, um als 'Shelf-Enzyme' zur Verfügung zu stehen. Außerdem sollten mit Hilfe neuer Screeningsysteme weitere Oxgenaseaktivitäten aus Umweltproben isoliert werden. Durch die Kombination von in silico und in vitro Methoden sollten die Katalysatoren in Ihrer Aktivität und Spezifität verbessert werden, um für die Anwendung interessant zu sein. Modul 1 Biooxidationen- Screeningsysteme zum Auffinden neuer Monooxygenasen für Hydroxylierungs- und Epoxydierungsreaktionen wurden erfolgreich entwickelt, validiert und zur BRAIN AG transferiert. Für die benannten Substrate und Substratklassen wurden Durchmusterungssysteme zunächst im 96-Well-Mikrotiterplatten entwickelt und publiziert (siehe Zwischenbericht). Aus der Stammsammlung der BRAIN AG und unterschiedlichster Umweltproben konnten so etwa 100 Stämme isoliert werden, die auf interessanten Kohlenwasserstoff-Verbindungen wachsen. Zur Identifikation und Isolierung der Volllängen-Gene neuer Monooxygenasen und der heterologen Darstellung der Enzyme wurde eine Genbank vom Isolat HD1106 erstellt. Für das Durchmustern der Metagenombank ist ein Assay in der Entwicklung, welcher auf Doppelemulsionen basiert, die in einem FACS sortiert werden. Diese Arbeiten werden Mitte Mai abgeschlossen sein. Außerdem wurde ein Nachweissystem für Aromatenhydroxylierungen auf der Basis von 4-Aminoantipyrin auf unsere Anwendung adaptiert. Beim Durchmustern von Sättigungsmutantenbibliotheken der Monooxygenase P450 BM3 wurden Varianten mit 8-fach erhöhter Aktivität für Phenoxytoluol aufgefunden. Das Epoxidnachweissystem wurde für die Styrolmonooxygenase StyAB optimiert und in einer ersten Runde der Gelenkten Evolution wurden drei Klone isoliert, die nach wiederholtem Durchmustern im Rohextrakt eine ca. zweifach erhöhte Aktivität zeigten. Der elektroenzymatische Prozess mit der Styrolmonooxygenase als Modellenzym wurde detailliert evaluiert und die grundlegenden Limitationen des Systems identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Regeneration des Kofaktors FAD zum FADH2 hochspezifisch abläuft. Die Hauptproblematik in diesem System besteht im sogenannten 'Sauerstoffdilemma'. Da bedingt durch die Reaktion es nicht in Frage kam, unter anaeroben Bedingungen zu arbeiten, wurde als Alternative ein artifizielles sauerstofftolerantes Deazaflavin synthetisiert und unter unseren Prozessbedingungen getestet. Leider konnte keine nennenswerte Aktivität mit diesen Kofaktor erzielt werden, weshalb nun hauptsächlich an prozesstechnischen Lösungen gearbeitet wird. usw.
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