Botulinumtoxin wird zur Behandlung von Krankheiten sowie in der ästhetischen Medizin eingesetzt. Obwohl Alternativen existieren, wird die Aktivität des aus C. Botulinum- Kulturen gereinigten Neurotoxins meist über einen Maus-Letalitäts-Test bestimmt. Bei Vorarbeiten wurden neuronale Tumorzelllinien entwickelt, in denen die Stimulus-abhängige Freisetzung eines in neurosekretorische Vesikel umgeleiteten Reporterenzyms durch Botulinumtoxin gehemmt wurde. Das System ist grundsätzlichen für die Bestimmung der Botulinumtoxinaktivität geeignet, weist aber noch Nachteile auf. Die empfindlichsten Zielstrukturen des Botulinumtoxins im Menschen sind Motoneurone. Daher soll das in den Vorarbeiten entwickelte Reportersystem in transgene humane Motoneurone (MNs) eingebracht werden, die aus neuronalen (NSCs) oder induzierten pluripotenten humanen Stammzellen (hiPSCs) differenziert werden. Damit könnten die Vorteile beider Systeme, die hohe Empfindlichkeit der aus Stammzellen differenzierten Neurone sowie das universell anwendbare und technisch einfache Nachweissystem, in einem Testsystem kombiniert werden. Ziel ist es, mit diesen Zellen einen praxistauglichen Test zu entwickeln, der die Bestimmung der Aktivität von Botulinumtoxin in pharmazeutischen Zubereitungen erlaubt und ein Alternativverfahren zum Maus-Letalitäts-Assay darstellt. 1) Testung unterschiedlicher Differenzierungsprotokolle und Stammzellen; 2) Charakterisierung der differenzierten Zellen bezüglich der Expression der als relevant identifizierten Botulinumtoxin-Targets; 3) Differenzierung nach den zuvor etablierten Protokollen der in Potsdam hergestellten transgenen Stammzellen, die das Reporterkonstrukt im AAVS1-Lokus integriert haben; 4) Stimulus-abhängige Freisetzung des Reporters ist in den aus transgenen Stammzellen differenzierten Motorneuronen 5) Validierung des Testsystems mit den neu etablierten Zellen an den Standorten Potsdam und Hannover von unabhängigen Experimentatoren.
Die gesetzlich vorgeschriebene Wirksamkeitsbestimmung der als Arzneimittel und Kosmetika hergestellten Botulinum-Neurotoxine BoNT/A und BoNT/B mittels LD50-Test erfordert jährlich über 600.000 Mäuse. Dieser qualvolle Tierversuch soll ersetzt werden. Wir wollen Assays entwickeln, die den Wirkmechanismus der Toxine (Bindung an Neuronen - Translokation in die Zelle - Spaltung neuronaler Proteine) in vitro abbilden. Botulinum-Neurotoxine wirken nach demselben Prinzip wie das Tetanus-Neurotoxin (TeNT). Wir haben bereits eine In-Vitro-Methode zur Bestimmung von TeNT entwickelt, die aktives Toxin anhand seiner Bindungsfähigkeit und Proteaseaktivität nachweist. Diese Strategie soll nun auf BoNT/A und BoNT/B übertragen werden und als Alternativtest dienen. Hierzu müssen zunächst die in dem Test verwendeten Bindungs- und Substratmoleküle an die Rezeptor- und Proteasespezifitäten der jeweiligen Botulinumtoxine angepasst und die Testbedingungen für jedes Toxin umfassend optimiert werden. Danach soll die Transferierbarkeit der Methode in andere Labore geprüft und ein Vergleich mit dem Tierversuch durchgeführt werden. Schließlich soll zur Validierung der Methode ein europäischer Ringversuch initiiert werden. Nach der Validierung wird eine Aufnahme der Methode in das Europäische Arzneibuch angestrebt, um eine breite Anwendung anstelle der LD50-Tests zu erreichen. Zudem soll geprüft werden, ob sich die Methode auch für weitergehende Anwendungen (z.B. Prüfung von Botulismusimpfstoffen) eignet.
Problemstellung und Zielsetzung: Erfassung der Nahrung, mit der das Gift von den Wasservoegeln aufgenommen wird; oekologische Voraussetzungen fuer die Vermehrung und Toxinproduktion von Clostridium botulinum. Methodischer Ansatz: 1. Nachweis von Clostridium botulinum im Biotop, in Kadavern und Nahrungsorganismen. 2. Chemische Wasseruntersuchungen, vor allem Stickstoff und Phosphor, Populationsuntersuchungen und quantitative Toxinnachweise bei Nahrungsorganismen (Fliegenlarven und -imagines), Plankton, Schlammfauna. 3. Quantitative Toxinnachweise im Verdauungstrakt der Wasservoegel, Nahrungsoekologie betroffener Vogelarten an den Lacken. Anwendungsgebiet: Seewinkellacken sind Rastplaetze von internationaler Bedeutung fuer Wasservoegel, Funktion durch Botulismus eingeschraenkt.
Ziele: Erfassung der Nahrung, mit der das Gift von den Wasservoegeln aufgenommen wird; oekologische Voraussetzungen fuer die Erhoehung der Toxinproduktion von Clostridium botulinum. Methoden: Nachweise von Cl botulinum im Biotop, in Kadavern und Nahrungsorganismen. Chemische Wasseruntersuchungen, Populationsuntersuchungen und quantitative Toxinnachweise bei Nahrungsorganismen (Fliegenlarven und -imagines, Plankton, Schlammfauna). Nahrungsoekologie betroffener Vogelarten an den Lacken. Nur wenige Arbeiten beschaeftigen sich mit den oekologischen Zusammenhaengen bei Wasservogel - Botulismus. Im Rahmen des Projektes soll ua geprueft werden, wieweit Zusammenhaenge zwischen Botulismus und Gewaessereutrophierung bestehen.
Das Vorhaben zielt auf die Herstellung eines Trägersubstrats für TiO2 - Partikel ab, die zur intensiven Entkeimung von Ab- und Brauchwässern mit Hilfe von UV-Strahlung genutzt werden. Das Substrat soll: - Keramischer Natur sein, da Träger auf Polymerbasis durch hohe Leistungsdichte der UV-Strahlungsquellen zerstört, die TiO2 - Partikel ausgeschwemmt werden und die Entkeimungszelle an Funktion verliert. - Eine hohe Oberfläche besitzen, damit die Kontaktfläche von Ab- oder Brauchwasser mit dem Trägersubstrat entsprechend hoch ist. - Zur Erzielung einer möglichst hohen Betriebssicherheit die Möglichkeit zur thermischen Reinigung von organischem Material bieten. - Für eine ozonfreie Entkeimung geeignet sein. Das Substrat soll in Form einer Entkeimungszelle Abwasser bis auf Trinkwasserqualität entkeimen, Brauchwasser von Biogasanlagen von Bakterien befreien (speziell vom anaerob lebenden Bakterium Clostridium Botulinum) oder Bohrschlämme entkeimen.
Klärung ob und ggf. wie eine Übertragung der Erreger auf den Menschen möglich ist. Umfassende Statuserhebung mit dem Ziel eine fundierte, Beurteilung von Befunden bei lebensmittelliefernden Tieren sowie in den entsprechenden Lebensmitteln zu ermöglichen. Umfassende Risikobewertung für ausgewählte Stoff-Erreger-Kombinationen
Projektziel war es, eine Ersatzmethode des bislang als 'golden standard' geltenden Mäuse-Bioassays ('Mäusetest') zum Nachweis von Clostridium botulinum-Neurotoxinen (Bont) in Lebensmitteln durch ein Real Time Reverse Transkriptase - PCR - Verfahren (Real Time RT - PCR) zu entwickeln. Clostridium botulinum (C. botulinum) ist ein obligat anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium, das zur Familie der Clostridiaceae gehört. Der weit verbreitete Erreger ist in der Lage, sieben verschiedene Neurotoxintypen (Bont/A-G) zu produzieren. Botulinumtoxine gelten als stärkste natürlich vorkommende Gifte, die beim Menschen und bei Tieren den Botulismus verursachen. Bei Lebensmittelvergiftungen stehen hauptsächlich die Typen A, B und E, seltener F, im Vordergrund, während bei den Tieren überwiegend die Typen C und D klinisch Botulismus hervorrufen können. Der klassische Nahrungsmittel-Botulismus ist eine lebensbedrohliche Intoxikation des Menschen. Nach einer Inkubationszeit von wenigen Stunden bis mehreren Tagen treten schwerwiegende Krankheitssymptome auf, die den Tod nach sich ziehen können. Die Untersuchung einer verdächtigen Lebensmittelprobe bedarf gemäß der DIN-Norm 10102/§ 64 LFGB, L 06.00-26 einer Anzahl von mindestens 54 Versuchsmäusen. Deshalb wurde als Alternativmethode ein Real Time Reverse Transkriptase-PCR-Verfahren (Real Time RT -PCR) zum Nachweis von C. botulinum Typ A-, B-, E- und F-Neurotoxinproduktion in Lebensmitteln entwickelt. Ein solches molekularbasiertes Verfahren dürfte gleichzeitig als Basis für die innovative Entwicklung von weiteren Ergänzungs- und Ersatzmethoden dienen. Es ist gelungen, ein molekularbasiertes Verfahren (Real Time RT-PCR-Verfahren) zu entwickeln, mit dessen Hilfe ein eindeutiger, sowohl qualitativer als auch quantitativer Nachweis einer Genexpression aller Lebensmittel-assoziierten C. botulinum Toxintypen (Typ A, B, E und F), einschließlich deren Subtypen, möglich ist. Als Ausgangsbasis zur Etablierung der neuartigen Methode dienten 67, mittels biochemischer, serologischer und molekularbiologischer Feindifferenzierungs- und Typisierungsverfahren als C. botulinum charakterisierte Stämme (24 Typ A-, 31 Typ B-, sechs Typ E- und sechs Typ F-Stämme). Durch die Etablierung entsprechender Primer-Sondensysteme konnte über dem Nachweis der mRNA und deren Transkription in die cDNA eine Bont A-, B-, E- und F-Produktion nachgewiesen werden. Die absolute Quantifizierung basierte auf einer dekadischen Verdünnungsreihe von Bont A-, B-, E- und F-cDNA und wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Die relative Quantifizierung der Bont A, B, E und F erfolgte durch den Einsatz eines als endogene Kontrolle fungierenden 'Housekeeping'-Gens, unter Einbeziehung der vergleichenden Ct-Methode. Auf dieser Weise konnte die tatsächliche Expression und somit die reale Menge an produziertem Neurotoxin ermittelt werden. Insgesamt kann eine Methodenkaskade vorgestellt werden, die als Alternative zum Mäuse-Bioassay dienen kann.
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