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Enzyme des mikrobiellen Abbaus von stickstoffhaltigen Heteroaromaten: Charakterisierung Molybdaen-haltiger Hydroxylasen und Heterozyklen spaltender Dioxygenasen, Charakterisierung von Heterozyklen spaltenden decarbonylierenden Dioxygenasen aus Bakterien und Pilzen

Untersuchung von Stoffwechselwegen des mikrobiellen Abbaus von Chinolinderivaten und von Flavonolen. Charakterisierung Ring-spaltender Enzymsysteme auf biochemischer, physikalischer und genetischer Ebene; Aufklaerung des Reaktionsmechanismus der oxidativen Decarbonylierung.

Mikrobieller Abbau von polychlorierten Phenolen

Isolierung von Chlorphenol-abbauenden Mikroorganismen. Charakterisierung der Abbauleistung. Untersuchungen zum Abbauweg (insbesondere von 2,4,6-Trichlorphenol). Isolierung und Identifizierung von Metaboliten. Reinigung und Charakterisierung von Enzymen aus dem Abbauweg.

Entwicklung eines innovativen Verfahrens zur selektiven Produktion von Carotinoid-Spaltungsprodukten durch Einsatz neuartiger Dioxygenasen im integrierten Bioprozess

Durch den oxidativen Abbau von Carotinoiden entstehen Apocarotinoide, die vielfältige Bioaktivitäten aufweisen, z. B. Aromastoffe, Farbstoffe und Vitamine. Die etherischen Öle vieler Pflanzen enthalten die zu den Apocarotinoiden zählenden C13-Norisoprenoide, z. B. Ionon und Damascenon, die entscheidend zu den Geruchseigenschaften dieser Pflanzen beitragen und damit interessante natürliche Aromen darstellen. Aufgrund der geringen natürlichen Konzentrationen ist ein Extraktion zur Gewinnung der Reinsubstanzen nicht ökonomisch durchführbar. Biotechnologisch lassen sie sich bisher nur durch eine unspezifische enzymatische Cooxidation durch verschiedene Oxidasen, z. B. Lipoxygenasen, in Gegenwart von Cooxidantien wie Linolsäure herstellen. In den letzten Jahren wurden die ersten pflanzlichen Carotinoid-spaltenden Dioxygenasen (CCD) identifiziert, eine neuartige Enzym-Untergruppe, die die selektive Oxidation von Doppelbindungen in Carotinoiden katalysiert. Im Rahmen dieses Projektes soll ein integrierter Bioprozess entwickelt werden, um mit Hilfe rekombinanter CCDs selektiv Norisoprenoid-verbindungen aus natürlichen Carotinoiden zu synthetisieren. Die Stabilisierung des Biokatalysators, die Darreichungsform der Substrate und die in situ-Produktisolierung der Zielverbindungen stellen dabei die entscheidenen Entwicklungsziele dar.

Mechanismen der enzymatischen Dehalogenierung

Chlorierte Kohlenwasserstoffe werden sowohl als Insektizide, Fungizide und Herbizide, als auch als Loesemittel, Kuehlfluessigkeiten und Schmiermittel viel verwendet. Leider werden diese Stoffe wegen der hohen Stabilitaet der Chlor-Kohlenstoff-Bindung in der Natur nur langsam abgebaut. Dehalogenierende Enzyme sind in der Lage, aus chlorierten Kohlenwasserstoffen das Chlor abzuspalten und damit diese meist umweltgefaehrdenden Stoffe zu entgiften. In dem vorliegenden Projekt wurden verschiedene Bakterien isoliert mit der Faehigkeit, chlorierte Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen. In diesen Bakterien konnten die Enzyme, die fuer die Abspaltung des Chloratoms verantwortlich waren, nachgewiesen und ihre Reaktionsmechanismen aufgeklaert werden. Dabei konnten einige Enzyme das Chlor durch Hydroxylgruppen aus Wasser ersetzen (z.B. bei Halogenalkancarbonsaeuren oder bei 4-Chlorbenzoesaeure), andere dagegen verwendeten den Sauerstoff der Luft (z.B. 2-Chlorbenzoesaeuredioxygenase oder 4-Chlorphenylacetat Dioxygenase). In einem Fall (Pentachlorphenol Dehalogenase) ist der Mechanismus noch strittig. Insgesamt konnte jedoch eine Reihe von dehalogenierenden Enzymen charakterisiert und ihr Reaktionsmechanismus geklaert werden. Weitere Enzyme werden derzeit noch bearbeitet.

Oxidation halogenierter Brenzcatechine durch neuartige bakterielle extradiol spaltende Dioxygenasen

Aktivierung von aromatischen Azo- und Nitroverbindungen für den aeroben mikrobiellen Abbau: Bildung dioxygenasefähiger Aminoaromaten durch Gratisreduktion (Phase II)

Aufklaerung neuartiger Stoffwechselwege des aeroben bakteriellen Abbaus von haloaromatischen Xenobiotika: 1,2,3,4-Tetrachlorbenzol

In dem vorgeschlagenen Forschungsvorhaben soll der Abbau der extrem persistenten Problemverbindung 1,2,3,4-Tetrachlorbenzol durch den Bakterienstamm Pseudomonas chlororaphis RW 71 untersucht werden. Es soll die Chlorbrenzkatechin-Dioxygenase des Stammes charakterisiert werden, der gegenueber den bisher beschriebenen ringspaltenden Dioxygenasen eine ungewoehnlich hohe Aktivitaet fuer Chlorbrenzkatechine aufweist. Da Hinweise fuer einen Abbau ueber chloriertes Maleylacetat vorliegen, soll der Schwerpunkt des Vorhabens in der Aufklaerung des bisher voellig unbekannten Mechanismusses der Eliminierung des Chlorsubstituenten in Position 3 des intermediaeren 2,3,5-Trichlormaleylacetats liegen. Neuartige Abbaumechanismen werden somit erwartet.

Lokalisierung und Charakterisierung der Substrat-Bindungsstelle in ringhydroxylierenden Biooxygenasen

Ziel des Vorhabens ist die Lokalisierung und Charakterisierung der Bindungsstelle des aromatischen Substrats ringhydroxylierender Dioxygenasen. Diese Klasse von Enzymen katalysiert den ersten Schritt im aeroben bakteriellen Abbau aromatischer Verbindungen, die oxidative Aktivierung des aromatischen Kerns, und wird zu den Schluesselenzymen dieses Abbauweges gerechnet. Im ersten Teil des Projektes soll ermittelt werden, welche Regionen der Polypeptidkette an der Substratbindung beteiligt sind und ob die Substratbindungsstelle einer als solche funktional auf andere Proteine uebertragbaren Domaene zugeordnet werden kann. Im zweiten Teil sollen Aminosaeurereste bzw. -substitutionen identifiziert werden, die fuer die Struktur der hydrophoben Bindungstasche von Bedeutung sind. Prinzip der Vorgehensweise ist a) die lokale Veraenderung der Proteinsequenz (gezielter und statistischer Austausch einzelner Aminosaeuren, Austausch ganzer Polypeptidsegmente) mittels verschiedener molekulargenetischer Techniken und b) die Ermittlung des Einflusses der Veraenderung auf die Substratbindung durch die erzeugten Proteinvarianten. Als Modellsystem wird eine Biphenyldioxygenase benutzt. Fuer Biphenyldioxygenasen sind die meisten Sequenzdaten sowie sehr viele unterschiedlich substituierte Substrate verfuegbar.

Gentechnologische Charakterisierung der Struktur und Expression von Genen bakterieller Dioxygenasen

Am Bereich Molekulargenetik wurden die Gene einer Naphthalendioxygenase kloniert. Im Rahmen des Vorhabens sollen die einzelnen Gene dieses Enzyms subkloniert und Untersuchungen zur Aufklaerung ihrer DNA-Struktur durchgefuehrt werden. Studien zur Expression der einzelnen Gene in E coli und in anderen gramnegetiven Bakterie sind geplant. Sie sollen Rueckschluesse auf die Funktion des Promotors und der anderen regulatorischen Sequenzen geben. Darueber hinaus sollen Arbeiten zur Klonierung weiterer Dioxygenase-Gene, die fuer Enzyme mit abweichender Substratspezifitaet kodieren, und zur Aufklaerung ihrer Struktur durchgefuehrt werden. Es ist vorgesehen, die klonierten Gene in E coli zur Ueberexpression zu bringen und die erhaltenen Bakterienstaemme zur Gewinnung der Dioxygenasen zu nutzen.

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