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From laboratory to field - Research on insecticide resistance using the example of a chimeric cytochrome P450 monooxygenase

Development of insecticide resistance in insect pest species is one of the main threats of agriculture nowadays. The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is the noctuid species possessing by far the most reported cases of insecticide resistance worldwide, correlated with one of the widest geographical distributions of any agricultural pest species. This turns H. armigera into an adequate model to study resistance mechanisms in detail. The main mechanisms underlying insecticide resistance are target side insensitivity and metabolism, mainly due to carboxylesterases and cytochrome P450 monooxygenases. Just recently, the resistance mechanism of an Australian H. armigera strain toward the pyrethroid fenvalerate was ascribed to a single P450, CYP337B3. CYP337B3 is a naturally-occurring chimera between CYP337B2 and CYP337B1 evolved by an unequal crossing-over event. This enzyme had acquired new and exclusive substrate specificities resulting in the detoxification of fenvalerate. This is the first known case of recombination as an additional genetic mechanism, besides over-expression and point mutation, leading to insecticide resistance. Therefore, CYP337B1, CYP337B2, and CYP337B3 are ideal candidates for studying structure-function relationships in P450s. The project aims to characterize amino acids that are crucial for the activity of CYP337B3 toward detoxification of fenvalerate. Additionally, cross-resistance conferred by CYP337B3 enables the determination of common structural moieties of pyrethroids favoring detoxification by CYP337B3 and those leading to resistance breaking. Pyrethroids with identified resistance breaking moieties could be used to control even pyrethroid-resistant populations of H. armigera. Another advantage of this system is the conferment of insecticide resistance by CYP337B3 that is not restricted to Australia but seems to be a more common mechanism as recently revealed by the finding of the chimeric P450 in a cypermethrin-resistant Pakistani strain. To shed light on the contribution of CYP337B3 to pyrethroid resistance of H. armigera and even closely related species worldwide, field populations from different countries will be screened by PCR for the presence of CYP337B3 and its parental genes. If applicable, the allele frequency of CYP337B3 will be determined being a convenient method to conclude the resistance level of the tested populations. Finally, the project will result in advising farmers on the control of populations of H. armigera and related species possessing CYP337B3. This will even become more important due to the climate change allowing H. armigera to spread northward including central Europe, where H. armigera is not yet able to survive wintertime.

Entwicklung von Schwingelarten als Bioenergiegras auf marginalen Standorten (FESERGY)

In diesem Projekt sollen die wichtigsten landwirtschaftlich nutzbaren Festuca-Arten hinsichtlich ihrer Eignung als Bioenergiegras für marginale Standorte züchterisch bearbeitet werden. In diesem Zusammenhang soll ein tetraploider Genpool bei Wiesenschwingel aufgebaut werden und die spezifischen Eigenschaften für Bioenergiegräser sollen sowohl beim Wiesen- als auch beim Rohrschwingel verbessert werden. Die für das Projekt vorgesehenen Festuca-Genotypen werden nach einer speziell für Bioenergiegräser entwickelten Merkmalskombination aus dem bestehenden DSV-Genpool selektiert. Die Wiesen- und Rohrschwingel- Genotypen werden mittels SSR-Markeranalyse auf ihre genetische Distanz untersucht. Anschließend werden gezielte, 'intelligente' Rekombinationen durchgeführt und die Nachkommen in Leistungs- und Beobachtungsprüfungen auf spezifische Energiegras- Merkmale geprüft. - Gentoypenselektion aus DSV-Genpool und Ermittlung der genetischen Distanz mittels SSR-Markeranalyse - Rekombinationen, anschließend Leistungs- und Beobachtungsprüfung sowie SSR-Markeranalysen und 'intelligente' Rekombination der Nachkommenschaften - Tetraploidisierung von Wiesenschwingel-Genotypen, anschließend Leistungs- und Beobachtungsprüfung sowie SSR-Markeranalysen und 'intelligente' Rekombination der Nachkommenschaften - Zeitgleich Durchführung von Demonstrationsexperimenten zum Nachweis der Leistungsfähigkeit von Festuca-Arten.

ERA-IB7 - OBAC: Überwindung energetischer Barrieren bei der acetogenen Umsetzung von CO2

Die Verwendung von CO2 als Rohstoff für die nachhaltige Produktion von Treibstoffen und Basischemikalien stellt eine umweltfreundliche Alternative zur Nutzung von energie- und kohlenstoffreichen Abfallgasen aus der Industrie dar und bietet die Möglichkeit, den Ausstoß von Treibhausgasen zu reduzieren. Für die Entwicklung von entsprechenden nachhaltigen Prozessen sind acetogene Bakterien besonders vielversprechend, da sie unabhängig von Licht und Sauerstoff die Energieträger H2 oder CO oder eine Mischung beider (Synthesegase) verwenden, um CO2 in höherwertige Produkte umzuwandeln. Hauptziel von OBAC ist es, energetische Barrieren acetogener Bakterien zu überwinden. Hierzu sollen wichtige Vertreter genetisch so verändert werden, dass sie mehr Energie generieren und somit die Produktionsleistung gesteigert wird. Darüber hinaus wird eine Erweiterung der Produktpalette bzgl. industriell relevanter Verbindungen angestrebt. Ein Ziel dieses Teilvorhabens ist es, die genetische Basis zur Erzeugung von Produktionsstämmen durch Genomsequenzierungen eines breiten Spektrums von acetogenen Bakterien zu erweitern. In Kombination mit Transkriptionsanalysen sollen neue Angriffspunkte zur Stammoptimierung und Erweiterung der Produktpalette mittels 'metabolic engineering' identifiziert werden. Diverse acetogene Bakterien sollen sequenziert und auf besondere Genkassetten für die Energiekonservierung untersucht werden, die für rekombinante Produktionsstämme relevant sein könnten. Diese rekombinanten Stämme werden ebenfalls sequenziert und validiert. Transkriptionsanalysen werden allen Verbundpartnern bei der Identifizierung von solchen Genen und Stoffwechselwegen dienen, die auf veränderte Wachstumsbedingungen, insbesondere auf den Einsatz der Gase des Industriepartners Arcelor reagieren. Der Fokus wird dabei auf den rekombinanten Stämmen bzw. Produktionsstämmen sowie den Untersuchungen des Expressionsniveaus von Genen mit Relevanz für die Acetonproduktion liegen.

ERA-IB7 - OBAC: Überwindung energetischer Barrieren bei der acetogenen Umsetzung von CO2

Die Einsatzmöglichkeiten der Gasfermentationstechnologie und die Verwendung von Kohlenstoffdioxid (CO2) als Rohstoff bieten umweltfreundliche Alternativen im Sinne der Wiederaufbereitung von energie- und kohlenstoffreichen Abfallgasen aus der Industrie. Die mikrobielle Fixierung und Umwandlung von CO2 in biologisch hergestellte Rohstoffe ermöglicht zudem die Reduktion des Ausstoßes von Treibhausgasen. Die besondere Gruppe der autotrophen acetogenen Bakterien betreibt einen Fermentationsprozess, der unabhängig von Licht und Sauerstoff ist. Die Energieträger, welche diese Bakterien nutzen, um CO2 zu verwerten, sind Wasserstoff oder Kohlenmonoxid oder eine Mischung aus beiden Energieträgern (Synthesegase). Das Ziel dieses Vorhabens ist die gentechnische Herstellung rekombinanter acetogener Bakterienstämme, welche derzeitige energetische Barrieren überwinden und erhöhte Wachstumsraten und Produktionsleistungen während der Gasfermentation erreichen. Diese optimierten Stämme werden anschließend für eine heterologe Acetonproduktion genutzt. Das Vorhaben ist in aufeinander aufbauende Arbeitspakete gegliedert, in denen rekombinante acetogene Bakterienstämme mittels gentechnischer Methoden hergestellt werden. Zum einen werden Stämme konstruiert, die zusätzlich auf einem Expressions-plasmid die Gene des ech-Clusters tragen. Zum anderen werden Stämme hergestellt, welche die met-Gene plasmidcodiert exprimieren. Die Durchführung der notwendigen Arbeiten erfolgt wie in der Vorhabensbeschreibung geschildert. Die verifizierten rekombinanten acetogenen Bakterienstämme werden an die Verbundpartner (1, 3 und 4) zur weiteren Bearbeitung verschickt. Die besten Stämme werden daraufhin weiter gentechnisch modifiziert und für eine heterologe Acetonproduktion optimiert. Der in der Vorhabensbeschreibung definierte Arbeitsplan sieht das Erreichen von drei Meilensteinen sowie drei Pflichtergebnissen (engl., Deliverables) vor.

Untersuchung von Einflussfaktoren auf den horizontalen Gentransfer in die bakterielle Endophytenflora von Forstgehölzen im Hinblick auf die Vermeidung des Eintrags replikationsfähiger rekombinanter DNA in die Umwelt

Ziel des Projektes ist es, Bedingungen zu charakterisieren, unter denen sich rekombinante Bakterien in der Endophytenmikroflora etablieren und Transferereignisse stattfinden können. Darüber hinaus richtet sich ein zweiter Schwerpunkt auf die Untersuchung des Austrags replikationsfähiger DNA in die Umwelt. Im Ergebnis der Analysen sowie in Auswertung vorhandener Daten zur Endophytenbesiedlung von in vitro Kulturen sollen schlussfolgernd Empfehlungen zur Minimierung des Endophytenbesatzes und des Risikos eines unerwünschten Gentransfers abgeleitet werden.

GABI-Future - GABI Poem: Aufklärung initialer Mechanismen der Pollen-Embryogenese für die wissensbasierte Entwicklung von Methoden zur Herstellung reinerbiger Rekombinanten, Teilprojekt A

ERA-IB 5: CO2Chem - Biologische Konversion von CO2 zur Plattform-Chemikalie 3-Hydroxypropansäure, Teilprojekt: Universität Frankfurt

Das Treibhausgas CO2 soll mit Hilfe von anaeroben Essigsäure-bildenden, rekombinanten Bakterien zu wertvollen Plattformchemikalien umgesetzt werden. In diesem Teilprojekt werden dafür benötigte Enzyme bereitgestellt und biochemisch / kinetisch charakterisiert. Die Untersuchungen erfolgen zuerst in den Ausgangsorganismen und später in den Produktionsstämmen. Durch gleichzeitigen Nachweis der Enzymmenge sollen mögliche Flaschenhälse in der Produktion der Plattformchemikalien erkannt und gebannt werden.

FP1-BAP, Genetic Manipulation of the anaerobe, Zymomonas Mobilis for Fermentation of waste Starch

Objective: Zymomonas bacteria could offer considerable potential for improved alcohol fermentation in comparison with yeasts. An efficient expression vector is, however, an absolute requisite to open the possibility of genetically engineered zymomonas. The bacteria could then be made able to use for example renewable carbon substrates abundant in agriculture wastes. General Information: An efficient expression vector shall be constructed for zymomonas mobilis. For this, the promotor of the pyruvate decarboxylase gene will be isolated, sequenced and built into a broad host range plasmid. Genes for the degradation of amylose (from aspergillus awamorii) or xylose (from klebsiella) shall be placed under control of this strong promoter and expression will be tested in suitable escherichia coli strains. Afterwards, these recombinant plasmids shall be introduced into zymomonas mobilis cells and their expression and stability will be assayed. The long range aim is to study the recombinant strains for continuous ethanol production from agricultural waste substrates as starch and hemicellulose (xylose). Achievements: Zymomonas mobilis is a Gram negative anaerobe producing ethanol 5 to 6 times faster than yeast. It can use only glucose, fructose and sucrose as carbon sources. Therefore, applications of Z mobilis at the industrial level require extention of its spectrum of usable carbohydrates. Genetic improvement was approached through formal genetics and genetic engineering. Chemical mutagenesis, transposon mutagenesis, gene transfer by aided conjugation, construction of recombinant expression vectors and transfer into Z mobilis genes responsible for xylose metabolism were established and can now be applied to increase the substrate range of Z mobilis. Recombinant plasmids were constructed by subcloning fragments of native Z mobilis plasmids in known vectors. These were transferred into Z mobilis by aided conjugation and were stably inherited, especially after the loss of native plasmids. Subcloned Z mobilis plasmid sequences were used to construct new expression vectors, which could be transferred into Z mobilis and induce expression of the xylose catabolism genes xylA and xylB. However, the engineered strains could not ferment xylose. Transformation of Z mobilis by plasmid deoxyribonucleic acid (DNA) occurred at low frequencies only when sequences of incoming plasmid were integrated into the host's genome. Transposon mutagenesis was accomplished by conjugal transfer of transposon bearing plasmids from Pseudomonas, as well as Escherichia coli donors to Z mobilis. All Z mobilis strains tested were able to ferment extracts of various fruits, such as apples, oranges, peaches, watermelons, etc.

ERA-IB 3: Überwindung der metabolischen Diversität und der Populations-Dynamik mikrobieller Zellfabriken (CONTIbugs)

Die Effizienz industrieller Ganzzell-Produktionsprozesse ist häufig beeinträchtigt durch die Bildung von Subpopulationen in einer mikrobiellen Kultur während einer Biotransformation oder Fermentation. Dieses Projektvorhaben untersucht das Phänomen metabolischer Diversität und der Populations-Dynamik in mikrobiellen Zellfabriken anhand verschiedener nicht pathogener Pseudomonas sp. sowohl in planktonischer Kultur, als auch in Oberflächen assoziierten Biofilmen, ausgelöst durch prozessrelevanten Stress. Als Modellreaktion wird die Synthese von Isobutanol und/oder Isobutyrats durch rekombinante Pseudomonas sp. eingesetzt. Ziel ist die Entwicklung von Pseudomonas Zellfabriken mit einer mindestens 10-fach verbesserten Prozessleistung hinsichtlich ihrer genetischen und phänotypischen Stabilität.

Molekulare Infektionsbiologie und Potenzial als biologisches Aphizid des insektenpathogenen Pilzes Lecanicillium

Arthropodenpathogene Pilze sind als Mittel der biologischen Bekämpfung bedeutender land- und forstwirtschaftlicher Schädlinge sowie der Vektoren von Infektionskrankheiten bei Tier und Mensch (Meningitis, Borreliose, Malaria, Dengue-Fieber, Chagas-Krankheit, Schlafkrankheit) von beträchtlichem sozialen und ökonomischen Interesse. Ein fundiertes Verständnis der Infektionsbiologie dieser Mikroorganismen, zu dem das vorliegende Projekt beitragen soll, ist unabdingbare Voraussetzung der Zulassung und Anwendung entsprechender Mykoinsektizide in nachhaltiger, ökosystem-verträglicher Landwirtschaft oder Vektorkontrolle. Anhand eines anwendungsrelevanten Wirt-Pathogen-Modells, der Wechselwirkung filamentöser Pilze der Gattung Lecanicillium mit Blattläusen, die weltweit als Schädlinge im Getreideanbau sowie in Obst- und Gartenbau von ökonomischer Bedeutung sind, sollen in der bilateralen Kooperation zwischen einem argentinischen und einem deutschen Projektpartner komplementäre methodologische Ansätze in innovativer Weise verknüpft werden. Wissenschaftliches Ziel der Kooperation ist es, i) potentielle Virulenzfaktoren insektenpathogener Lecanicillium-Stämme durch gezielte genetische Rekombination zu inaktivieren und ii) den Einfluss dieser genetischen Modifikation auf Virulenz und Sekundärmetabolitproduktion der Pilze zu bestimmen. Hierdurch sollen zum einen Erkenntnisse zur molekularen Grundlage von Virulenz und Wirtsspezifität des Pilzes Lecanicillium gewonnen und mit den zu anderen arthropoden-assoziierten Pilzen vorliegenden Erkenntnissen verglichen werden, um verbreitete Pathogenesestrategien und spezifische Adaptationen zu identifizieren. Zum anderen sollen pathogeneserelevante Sekundärmetabolite identifiziert und geprüft werden, ob diese Verbindung zur Bekämpfung von Blattläusen eingesetzt werden könnten.

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