Untersuchung der Wirkungsmechanismen von Ochratoxin A, Citrinin, Patalin und Penicillsaeure. Ochratoxin A, ein nephrotoxisches Mycotoxin aus Aspergrelus ochraceus hemmt die Phenylalanyl-t RNA-Synthetase von Enkarykuoten und Prokaryonten. Der Hemmungstyp ist kompetitiv. Daher kann die Hemmwirkung auf Hepatom-Gewebekulturzellen, der letale Effekt auf Maeuse und der Effekt auf Makrophagen-Migration und Immunosuppression durch Phenylalanin aufgehoben werden. Citrinin, ein nephrotoxisches Mycotoxin aus Penicillium citrinum, hemmt in vivo vor allem RNA und DNA-Synthese. Patulin und Penicillsaeure reagieren mit SH- und NH2-Gruppen und haben deshalb vielfaeltige Wirkungen. Plasmid-DNA und t-RNA reagieren mit diesen Mycotoxinen.
Wir untersuchen, wie funktionell unterschiedliche M1- und M2-Makrophagen-Phänotypen miteinander kommunizieren, um mikrobielle Infektionen abzuwehren und die Gewebshomöostase im Wirt wiederherzustellen. Dabei konzentrieren wir uns auf Lipidmediatoren als Signalmoleküle, die durch mikrobielle Exotoxine in Makrophagen gebildet werden und damit Phagozyten und andere Immunzellen steuern. Wir prüfen, ob die gezielte Manipulation von Lipidmediatoren mit Wirkstoffen, insb. Naturstoffe aus anderen Organismen, genutzt werden kann, um zelluläre Wirtsfunktionen so zu modulieren, dass mikrobielle Infektionen effektiv bekämpft werden und die Homöstase wiederhergestellt wird.
Ziel der Studie ist es, die regulativen Mechanismen der Genexpression der wichtigsten Antioxidantien Cu++/Zn++ Superoxid-Dismutase (Cu/ZnSOD) der Mn Superoxid Dismutase (MnSOD) und der Katalase in Bezug 1 ) auf die verwendeten Fasern und Staeube (Krokydolith, Quarz (SiO2), Stein- und Basaltwolle) und die Expositionsdauer und 2) im Hinblick auf die sie positiv beeinflussenden Zytokine zu analysieren. Dazu sind folgende Untersuchungen geplant: a) in vitro Exposition kultivierter BEAS ZB Zellen mit steigenden Faser-/StaubKonzentrationen (24 h+48 h), b) Durchfuehrung der u.g. Tests in der in vivo gewonnenen bronchoalveolaeren Lavage (BAL) und an Bronchialschleimhautbiopsien (Patienten mit einer Anthrakosilikose, Asbeststaub-exponierte Patienten, nicht Faser-/Staub-Exponierte als Kontrolle), und c) ex vivo Kultivierung der gewonnenen alveolaeren Makrophagen (AM) und Exposition von BEAS 2B Zellen mit dem Ueberstand dieser AM. In den o.g. Proben sind folgende Messungen geplant: Bestimmung der Genexpression (Gen-Sonden: Cu/ZnSOD, MnSOD und Katalase) mittels Northern-Blot-Analysen (in vitro Faser-/Staub-exponierte BEAS 2B), in situ Hybridisierungen (Bronchialschleimhaut-Biopsien) und Durchfuehrung der semiquantitativen PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) in den Biopsien ud den mit dem Ueberstand der AM exponierten BEAS 2B Zellen. Dazu ergaenzend sollen die folgenden Antioxidantien und Zytokine quantifiziert (ELISA) werden: Cu/ZnSOD, MnSOD, Katalase, IL1, IL8, TNFalpha (intrazellulaer in beiden BEAS 2B-Ansaetzen, BAL).
Die Bevoelkerung in gemaessigten Klimazonen verbringt die ueberwiegende Zeit in geschlossenen Raeumen. Die Schadstoffbelastung in Innenraeumen beinhaltet vor allem Feinstaeube und anorganische Reizgase in unterschiedlichen Zusammensetzungen. Alveolarmakrophagen (AM) stehen dabei in permanenten Kontakt mit den Luftverunreinigungen. In einem in-vitro-Modell werden die Auswirkungen der Feinstaubexposition (Printex 90, Flammruss, Titandioxid, Chrysotil B und, wenn moeglich, kuenstliche Mineralfasern) auf AM und ihre Vorlaeuferzellen, die Blutmonozyten (BM) allein, sowie unter additiver Reizgasexposition mit Stickstoffdioxid (NO2) untersucht. Die verschiedenen physiko-chemischen Inhalationsnoxen koennen Entzuendungsreaktionen von Lungenparenchym und Interstitium hervorrufen. Hierbei interessiert uns, wie sich unterschiedliche Feinstaeube unter zusaetzlicher NO2-Exposition auf die Aktivierung der AM und BM auswirken. Es bleibt zu untersuchen, welche Mediatoren freigesetzt werden und wie sie die Induktion und Unterhaltung von Entzuendungsvorgaengen mit den daraus resultierenden Krankheitsbildern bewirken. Zur Durchfuehrung dieser Versuche werden AM und BM einer Suspension, bestehend aus niedrig konzentrierten Feinstaeuben und Kulturmedium, ausgesetzt. Zur Schadgasexposition werden die Zellen auf einer dem Kulturmedium aufliegenden permeablen Membran plaziert und in einem Begasungszylinder dem direkten Kontakt mit NO2 in umweltrelevanten Konzentrationsbereichen exponiert. Es ist beabsichtigt, die bestehende Versuchsanordnung zur Schadgas- und Partikelexposition zu optimieren. Weiterhin sollen entzuendungsinduzierende Mediatoren nach Partikel- und Schadgasexposition von AM und BM bestimmt werden. Hier sind die Freisetzungen von radikalen Sauerstoffmetaboliten und die Zytokine IL-1, IL-6, IL-8 und der Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-alpha) sowie TGF-beta zu nennen. Untersucht werden soll, ob die unterschiedlichen Feinstaeube bzw. Fasern verschiedene Freisetzungsmuster der genannten Mediatoren durch AM und BM bewirken. Es soll der Einfluss von einzelnen Feinstaeuben sowie von Feinstaub/NO2-Koexpositionen auf die die Chemotaxis induzierenden Eigenschaften der AM und BM in vitro mit einer Chemotaxis-Kammer untersucht werden. Ebenfalls soll die Phagozytoseaktivitaet der AM und BM vor und nach Exposition mit den oben genannten niedrig konzentrierten Partikeln und Fasern quantifiziert werden. In ersten Versuchen des seit Juni 1994 laufenden Projekts wurden Experimente zur Optimierung der Schadgasexposition der Monozyten/Makrophagen durchgefuehrt. Es wurden unterschiedlich beschichtete Polykarbonatmembranen mit differenten Porengroessen hinsichtlich der Aktivierung, Adhaerenz und zytotoxischen Wirkung auf AM und BM untersucht. Es konnten keine wesentlichen Unterschiede zwischen unbehandelten und mit Humalbumin bzw. Kollagen beschichteten Polykarbonatmembranen beobachtet werden.
Strahlentherapien (inklusive Strahlendiagnostik) in Kombination mit Chemo-/Immuntherapien oder anderen Neurotoxinen verursachen schwere Nebenwirkungen wie kognitive Beeinträchtigungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht bekannt, korrelieren aber mit einer gestörten Neurogenese/-regeneration. Im Forschungsvorhaben wird basierend auf humanen embryonalen Stammzellen eine in vitro (organoide) Kultur etabliert, die die Neurogenese/-regeneration mit den beteiligten Zelltypen des Gehirns wie Neurone, Gliazellen und Mikroglia/Makrophagen nachbildet. Klinisch relevante Kombinationen von Strahlen- (Röntgen und Kohlenstoffionen) und Chemo-/oder Immuntherapien und andere Neurotoxine (z.B. Antikonvulsiva) werden anhand des Brain-Radiation-Assays getestet und die Signalkaskaden und Regulatoren identifiziert, die für die eingeschränkte neuronale Funktion verantwortlich sind. AP2.1 Transfer des neuronalen Differenzierungssystems für die MEA Methode; AP2.2 Elektrophysiologische von aus Stammzellen differenzierten neuronalen Zellen nach kombinierter Strahlen- und Medikamenteneinwirkung; AP2.3 Elektrophysiologische und immunchemische Untersuchung von Neuronen/Mikroglia Ko-Kulturen nach kombinierter Strahlen- und Medikamenteneinwirkung.