Das YEASTPEC-Konsortium will die fermentative Verwertung von Pektin bzw. Pektinbausteinen (v.a. D-Galakturonsäure, GalA, und Arabinose, Ara), einem Reststoff der Agroindustrie, durch entsprechend modifizierte Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae erreichen. In dem Teilvorhaben des Verbundpartners GEM sollen Enzyme identifiziert werden, die für die Freisetzung der monomeren Bestandteile von Pektin geeignet sind und in Hefe exprimiert werden können.
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae hat sich als ein beliebter Produktionsorganismus in der industriellen Biotechnologie etabliert. Dies beruht auf der außergewöhnlichen Einfachheit, mit der man hier zielgerichtete genetische Modifikationen durchführen kann. Tatsächlich konnten bereits einige natürliche Limitationen der Bäckerhefe überwunden werden, die anfangs einer Nutzung von Abfallbiomasse als Rohstoff entgegenstanden. Ein robuster genetisch veränderter Industriestamm, der Inhibitoren in Lignozellulose-haltigen Hydrolysaten tolerieren und neben Glukose auch Xylose zu Ethanol vergären kann, steht als Ausgangsplattform für das YEASTPEC Projekt zur Verfügung. Neben Lignozellulose-haltigen Abfallströmen gibt es preiswerte agro-industrielle Nebenströme, die reich an Pektin sind und daher ebenfalls attraktive Substrate für die industrielle Biotechnologie darstellen. In Europa, ist vor allem das gepresste Fruchtfleisch von Zuckerrüben (Zuckerindustrie) und Früchten (Fruchtsaftindustrie) in hohen Mengen verfügbar. Außer Glukose, sind die Hydrolysate dieser bisher weitgehend unerschlossenen Rohstoffe reich an Galakturonsäure (GalA) und Arabinose. Innerhalb des YEASTPEC Projektes soll ein robuster Industriestamm entwickelt werden, der Enzyme für die Hydrolyse der Polysaccharide in pektinhaltigen Abfällen ausscheiden und alle im Hydrolysat vorherrschenden Zucker, d.h. Glucose, GalA und Arabinose zu Ethanol vergären kann. Das inherente Redoxproblem des Stoffwechselweges für die GalA Vergärung soll durch Zufütterung von Glycerol gelöst werden, wodurch zusätzliche Reduktionsequivalente bereit gestellt werden. Glycerol ist das hauptsächliche Nebenprodukt der gegenwärtigen Biodieselproduktion und steht daher ebenfalls in hohen Mengen preiswert zur Verfügung. Der generierte Industriestamm soll zusätzlich für eine erhöhte Robustheit während der industriellen Fermentation, insbesondere gegenüber schwachen Säuren, verbessert werden.
Pflanzen sind den verschiedensten Fremdstoffen ausgesetzt, u.a. auch den von Menschen eingesetzten Xenobiotika, die Bestandteile von Herbiziden, Insektiziden und Wachstumsregulatoren sind. Diese Xenobiotika werden häufig nach Konjugation mit dem Tripeptid Glutathion metabolisiert, kompartimentiert und damit physiologisch inaktiviert. Aber auch endogene Metabolite können in der Pflanze an Glutathion konjugiert und abgebaut werden. Die molekularen Komponenten des pflanzlichen Glutathion-Konjugat-Katabolismus und deren Funktionen sind allerdings noch wenig verstanden und sollen näher untersucht werden. Es ist vorgesehen, diesen metabolischen Weg in Saccharomyces cerevisiae zu modellieren. Die Hefe ist ein ideales System, um den Glutathion Konjugat-Abbau zu rekonstituieren und zu analysieren. Die gewonnenen Erkenntnisse werden zurück auf das Pflanzensystem übertragen. Zusätzliche Ziele sind die funktionellen Analysen der pflanzlichen Glutathion-S-Transferasen und der Phytochelatin-Synthase beim Konjugat-Metabolismus. Zu diesem Ziel werden durchgeführt: i) Expressionsanalysen in Hefe, um Substrat-Spezifitäten innerhalb der Familie der Glutathion-S-Transferasen zu charakterisieren; ii) pflanzengenetische Ansätze, um synthetisch erzeugte Mutanten in Abhängigkeit von der Funktion der Phytochelatin-Synthase zu erkennen; iii) Analyse des Schwefel-Metaboloms in Arabidopsis durch Einsatz von stabilen Schwefel-Isotope und ultrahochauflösender Massenspektroskopie, um die Änderungen in den Poolgrößen von Glutathion und seinen Derivaten zu verfolgen.
Die Verwertung von Rohglycerolabfällen kann die Wirtschaftlichkeit der Biodieselproduktion erheblich verbessern. Um dieses Ziel mit Hilfe von Biokatalaysatoren zu erreichen, sind die Umsatzrate von Glycerol zu Produkten, die Integration von Prozessschritten und die Toleranz von Produktionssstämmen gegenüber den Verschmutzungen in Rohglycerol die zentralen Herausforderungen. Zwei wertvolle Produkte sollen aus Glycerol mit Hilfe von modifizierten Hefen als Biokatalysatoren hergestellt werden. Das Konsortium besteht aus industriellen und akademischen Partnern, die Expertisen in Bioprozess- und Zellengineering, in omics Technologien und in der Systembiologie aufweisen. Wir werden die Hefen Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris mit den erforderlichen Genen/Stoffwechselwegen für die Herstellung von chiralen Aminoalkohole (CAA) und 1,2-Propandiol (PDO) ausstatten. Die Zellen werden sowohl mit Hilfe von Hochdurchsatz-Microscale Prozesstechniken als auch im größeren Maßstab charakterisiert. Daten von Transkriptom- und metabolischen Fluxanalysen werden mit Prozessdaten integriert und die Ergebnisse werden verwendet, um Stoffwechselwege und die 'Chassis'-Organismen zu optimieren. Diese Schritte werden wiederholt und werden eine zweite bzw. dritte Generation von verbesserten Biokatalysatoren hervorbringen. Die neuen Stämme, Prozesse und integrierten Methoden werden für die Biodieselindustrie im speziellen und für die Industrielle Biotechnologie im Allgemeinen von Nutzen sein.
Zur Gewinnung chiraler Bausteine werden heute überwiegend chemisch katalysierte Reduktionen eingesetzt. Die technische Durchführung erfolgt in der Regel unter extremen, energieintensiven Reaktionsbedingungen, Einsatz giftiger und Umwelt belastender Schwermetallkatalysatoren und Verwendung großer Mengen organischer Lösungsmittel. Auf der anderen Seite zeigen einige Prozessbeispiele, dass die Biokatalyse unter ökonomischen Gesichtspunkten mit der chemischen asymmetrischen Synthese durchaus konkurrieren und dabei ökologische Vorteile aufweisen kann. Besonders das Potential der Bäckerhefe zur stereoselektiven Reduktion vieler (strukturell einfacher) prochiraler Ketone ist auch im präparativen Maßstab gut dokumentiert. Zur effektiveren Durchführung von Hefereduktionen wurde daher ein rekombinanter Hefestamm entwickelt (Coexpression einer Carbonylreduktase und eines Cofaktor-Regenerierungsenzyms). Im Vergleich zu Wildtyp-Zellen konnten damit Biotransformationsgeschwindigkeiten und Ausbeuten effektiv gesteigert werden. Allerdings zeigte sich, dass die erzielbaren Enantioselektivitäten sehr von den Kultivierungsbedingungen bei der Herstellung des Biokatalysators abhängen. Zielsetzung dieses Forschungs- und Entwicklungsvorhabens ist daher die Entwicklung eines effektiven Produktionsverfahrens zur Herstellung von rekombinanten Bäckerhefen für enantioselektive Reduktionen. Prozessbeispiel ist die asymmetrische Reduktion von 4-Cl-Acetessigsäureethylester (4Cl-ACE) zu (S)-4-Cl-3-Hydroxy-Buttersäureethylester (S-CHBE). S-CHBE mit einem Marktvolumen von mehreren 100 jato wird industriell zur Synthese von Cholesterinsenkern eingesetzt. Da zur Optimierung der Herstellung dieses Biokatalysators zahlreiche Experimente im pH-kontrollierten Rührkesselreaktor erforderlich sind, soll eine neue Paralleltechnik weiterentwickelt und eingesetzt werden, die es erlaubt, bis zu 48 pH-kontrollierte Fedbatch-Experimente in parallelen Rührkesselreaktoren automatisiert durchführen zu können.
Im Rahmen des Forschungsvorhabens wurden die Schwermetallgehalte verschiedener Brennereirohstoffe ermittelt. Am Beispiel einer melasseverarbeitenden Brennerei wurde der Weg der Schwermetalle vom Rohstoff ueber die einzelnen Verarbeitungsschritte, Gaerung, Destillation bis hin zur Schlempe bilanziert. Der Einfluss von vier ausgewaehlten Schwermetallen auf die Stoffwechselaktivitaet der Brennereihefe Saccharomyces cerevisiae wurde in Laborexperimenten bestimmt. Den Abschluss der Untersuchungen bildete die Entwicklung eines biologischen Verfahrens, das die Abtrennung von Schwermetallen aus dem organisch hoch belasteten Brennereiabwasser - Melasseschlempe - ermoeglicht. Die Bilanzierung zeigte, dass die im Brennereiabwasser detektierten Schwermetallkonzentrationen primaer auf die eingesetzten Rohstoffe zurueckzufuehren sind. Eine Ueberschreitung der gesetzlichen Grenzwerte nach der Indirekteinleiterverordnung konnte dabei fuer die Metalle Blei, Kupfer, Kobalt, Nickel und Zink beobachtet werden. Ein negativer Einfluss der detektierten Schwermetalle auf den adaptierten Produktionsstamm Saccharomyces cerevisiae konnte nicht nachgewiesen werden. Die Abtrennung der Schwermetalle aus dem Brennereiabwasser wurde durch biologisch induzierte Sulfid-Faellung realisiert. Die Untersuchungen wurden an einer anaeroben Abwasserreinigungsanlage mit einem Gesamtvolumen von 0,2 m3 durchgefuehrt. Bereits in der ersten, hydrolytischen Stufe fand eine quantitative Reduktion von Sulfat zu Sulfid statt. Um eine Hemmung der methanogenen Bakterien der zweiten Stufe zu verhindern, wurde ueberschuessiger Schwefelwasserstoff durch eine mit Kohlendioxid im Gegenstrom betriebene Strippingstufe ausgetrieben. Die Abtrennung des schwermetallsulfidhaltigen Ueberschussschlammes erfolgte durch zweistufige Sedimentation mit Rueckfuehrung. Hierbei fielen je 100 m3 Abwasser etwa 1,3 m3 Ueberschussschlamm an. Die Schwermetallkonzentrationen im Klarlauf wurden dabei im Durchschnitt um einen Faktor 10 im Vergleich zum unbehandelten Abwasser reduziert und die gesetzlichen Grenzwerte zum Teil deutlich, mindestens jedoch um den Faktor 2, unterschritten.
Current agriculture requires high inputs of nitrogen fertilizers, causes many secondary problems like nitrate leaching, contamination of the ground water, and the accumulation of nitrate in edible plant parts up to human-toxic concentrations. Therefore, an important future development in agroindustry will be identification or development of plants that are able to efficiently use low nitrogen levels in soils by maintaining high crop yield and quality. NH4+ transporters must play a strategic role in plant nitrogen efficiency. Despite their importance, the first ammonium transporters were cloned just recently, from the yeast Sacchraromyces cerevisiae and the plant Arabidopsis thaliana, by two participants of this project. The two proteins (MEP1/AMT1) are highly similar in sequence and define a new family of transporters also conserved in bacteria and animals. Preferential expression of plant NH4+ transporters in root hairs is strongly indicative of a pivotal role in nitrogen nutrition. EURATINE's objective is to use this recently acquired knowledge to perform an exhaustive molecular analysis of NH4+ transport proteins in the model plant Arabidopsis thailiana and to characterise their role in uptake of NH4+ from the soil and/or from symbiotic bacteria. Ammonium uptake into and efflux from nitrogen-fixing bacteria will also be analyzed with respect to their propensity to modulate legumes. In parallels, a targeted analysis of NH4+ transporters will be carried out in the yeast Saccharomyces cerevisiae, which will be used both as an essential tool to characterise plant transporters and as a model to study regulatory mechanisms in NH4+ transport.
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