Various species of pest insects cause substantial damage to agriculture every year, or transmit deadly diseases to animals and humans. A successful strategy to control pest insect populations is based on the Sterile Insect Technique (SIT), which uses the release of mass-reared, radiation sterilized male insects to cause infertile matings and thus reduce the pest population level. However, irradiation is not applicable to every insect species. Thus, new strategies based on genetic modifications of pest insects have been developed or are currently under investigation.The goal of the proposed research is to improve the development and ecological safety of genetically engineered (GE) insects created for enhanced biological control programs, including the SIT and new strategies based on conditional lethality. A major concern for GE insect release programs is transgene stability, and maintenance of their consistent expression. Transgene loss or intra-genomic movement could result in loss of strain attributes, and may ultimately lead to interspecies movement resulting in ecological risks. To address potential transgene instability, a new transposon vector that allows post-integration immobilization will be tested in the Mediterranean, Mexican and Oriental fruit fly tephritid pest species. In addition, the system will be established in the mosquito species Aedes and Anopheles - carriers of dengue and malaria.Random genomic insertion is also problematic for GE strain development due to genomic position effects that suppress transgene expression, and insertional mutations that negatively affect host fitness and viability. Diminished transgene expression could result in the unintended survival of conditional lethal individuals, or the inability to identify them. To target transgene vectors to defined genomic insertion sites having minimal negative effects on gene expression and host fitness, a recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) strategy will be developed that. RMCE will also allow for stabilization of the target site, will be tested in tephritid and mosquito species, and will aid to the development of stabilized target-site strains for conditional lethal biocontrol. This will include a molecular and organismal evaluation of an RNAi-based lethality approach. Lethality based on an RNAi mechanism in the proposed insects would increase the species specificity and having multiple targets for lethality versus one target in existing systems. By seeking to improve transgene expressivity and stabilization of transposon-based vector systems, this proposal specifically addresses issues related to new GE insects by reducing their unintended spread after field release, and by limiting the possibilities for transgene introgression.
Das strikt anaerobe, Endosporen-bildende Bakterium Clostridioides difficile ist der Verursacher von nosokomialen Durchfallerkrankungen bei Mensch und Tier. Eine C. difficile Infektion (CDI) erfolgt meist nach einer Antibiotikabehandlung welche die Darmflora schädigt und bei der Wiederbesiedlung das Auskeimen von C. difficile ermöglicht. Weltweit ist eine Zunahme der Inzidenz so wie ein schwerer Verlauf von CDI zu beobachten was die Gesundheitskosten in die Höhe treibt und verstärkte Maßnahmen zur Infektions-Prävention und Kontrolle der Ausbreitung erfordert. Die Behandlung einer CDI wird dadurch erschwert dass Endosporen resistent gegenüber einer Antibiotikabehandlung sind. Vegetative Zellen und Sporen des Darmbesiedlers C. difficile werden mit den Fäzes ausgeschieden und können so in die Umwelt gelangen. C. difficile wird in Fäkal-belasteten Matrices wie Abwasser, Klärschlamm, Gülle und in mit Fäkalien in Berührung gekommenem Viehfutter oder Silage nachgewiesen. Durch den rasanten Anstieg der Anaerobtechnologie in Biogasanlagen zur Schlamm- oder Güllebehandlung kann davon ausgegangen werden, dass C. difficile in solchen Milieus überlebt oder sich sogar vermehrt und mit den Gär-Rückständen als Dünger in der Umwelt verbreitet wird. Ziel des geplanten Forschungsvorhabens ist, solche fäkal-belasteten Proben zu identifizieren und daraus C. difficile zu quantifizieren und Isolate zu charakterisieren. Neben dem Nachweis der Gene der Virulenzfaktoren für das Enterotoxin A und Cytotoxin B und dem binären Toxin CDT werden die Isolate einer Ribotypisierung und einer Antibiotikaempfindlichkeitstestung zur MHK Bestimmung unterzogen. Zudem sollen auch Antibiotika-Resistenzgene sowie konjugative Transposons nachgewiesen werden. Zum quantitativen Nachweis von C. difficile und dem Antibiotikaresistenz-vermittelnden konjugativen Transposon Tn5397 soll eine qPCR etabliert werden die es ermöglicht, Zellzahlen und Pathogenität von C. difficile in Fäkal-belasteten Proben zu bestimmen. Bedingt durch den hohen Stellenwert der Anaerobtechnologie für die Abwasserreinigung und Güllebehandlung sollen im Labormaßstab Biogasreaktoren aufgebaut und unter 'Realbedingungen' betrieben werden, um das Überleben, eine Vermehrung oder die Reduktion/Elimination von C. difficile Zellen/Sporen sowie die Exkretion des konjugativen Transposons Tn5397 zu testen. Diese Versuche sollen auch in Laboranlagen zur Simulation der konventionellen Güllelagerung sowie nach Behandlung in einer Labor-Ozonierungs- und UV-Entkeimungsanlage durchgeführt werden. Letztere werden unter anderem als vierte Reinigungsstufe zur Abwasserbehandlung in der Praxis empfohlen. Nur in Kombination von Umweltmikrobiologie und Verfahrenstechnik können die gesetzten Ziele erreicht und neues Wissen generiert werden um Aussagen bezüglich der Überlebensfähigkeit, Pathogenität und Verbreitungspfaden von C. difficile zu treffen und um das Infektionsrisiko für Mensch und Tier besser abschätzen zu können.
Doppelsträngige (ds)RNA-Moleküle lösen RNA-Silencing, sog. RNA-Interferenz (RNAi), aus. Dies ist ein konservierter Mechanismus, der eine entscheidende Rolle bei Wachstum, Entwicklung, Wirtsabwehr von Pathogene und Transposon-Inaktivierung in Pflanzen, Pilzen und Tieren spielt. Ein wichtiges Merkmal von RNAi ist die Verarbeitung von dsRNA zu kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) durch die Aktivität von DICER (Dcr) bzw. in Pflanzen DICER-LIKE Enzymen (DCL). Die siRNAs werden dann in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) integriert, um den Abbau von komplementärer Ziel-RNA zu steuern. DsRNAs, die extern in Pflanzenzellen eingeschleust werden, werden ebenfalls von DCLs abgebaut, was zur Anhäufung von siRNAs führt, die dann den Abbau homologer RNA (Taget-RNA) bewirken. Da dsRNAs in vitro hergestellt und angewendet werden können, lassen sie sich so entwerfen, dass sie auf eine bestimmte Sequenz abzielen. Somit wird dsRNA mit einer Sequenzhomologie zu einem essentiellen Gen eines Pathogens zur Zerstörung des jeweiligen Transkripts führen, was die Vermehrung und das Überleben des betreffenden Pathogens beeinträchtigt. Wir beabsichtigen daher, dsRNA-Moleküle zu designen, die über Sequenzhomologie lebensnotwendige Gene von H. fraxineus stilllegen, und damit die Infektion zum Stillstand bringen. Aus den Transkriptomdaten, die von uns selbst erzeugt, bzw. die von Konsortialpartnern bereitgestellt werden, können die Sequenzen lebensnotwendiger Gene von H. fraxineus identifiziert werden Diese dsRNA-Moleküle sollen mit der von uns entwickelten Stamminjektion in infizierte Eschensämlinge, die im Rahmen des Verbundes zur Verfügung gestellt werden, eingebracht und ihre Wirksamkeit überprüft werden. Wir konnten bereits zeigen, dass nach Stamminjektion die verwendeten RNA-Moleküle effizient aufgenommen und systemisch in den betreffenden Pflanzen transportiert werden, daher scheint diese Applikationsmethode für die Bekämpfung von H. fraxineus besonders geeignet.
Objective: Microorganisms deliberately released into the environment after rigorous testing are unlikely to prove a direct threat (i.e. as pathogens), and prediction of such risks is almost impossible. However, the main risk is the prospect of creating potentially hazardous new organisms following the transfer of mobile genes to native bacteria. Many bacteria can exchange genetic material, including plasmids and transposons; therefore the persistence and spread of both the organisms and genes are both important and would be affected by a variety of selective pressures. The results to be expected by this study are relevant at the methodological level as well as for its long term objectives. Techniques for sampling bacteria in the soil and for screening for the spreading of the manipulated microorganisms in the field, should be standardized. A precise evaluation of the effect of the selection pressure effect in the field of different systems should be obtained. An overall assessment of potential risks involved in the release of the respective bacteria into the environment would come from the analysis of the persistence of the inoculant strains in the field and from the evaluation of the transfer of the introduced genes to other bacteria in the soil. General Information: Aim of the research to be conducted in this research project is, - in cooperation with two other European laboratories - to monitor the persistence of genetically manipulated bacteria introduced into agricultural soils and to screen for the spread of genes carried by these micro-organisms to other members of the soil flora. Screening for the spreading of the genes will be performed by selection for the antibiotic resistance markers and by specific hybridization of DNA from the field strains with labelled probes for the introduced genes. Achievements: To investigate survival of introduced strains and their genes and to develop and assess monitoring methods, genetically marked derivatives of 2 common soil bacteria were used: Rhizobium which fixes atmospheric nitrogen in the root nodules of legumes (and has a long history) of safe and effective use as an agricultural inoculant) was used in both field and laboratory experiments; Enterobacter agglomerans which fixes nitrogen in association with cereal roots was studied in the laboratory. Strains were marked with genes conferring antibiotic resistance, either by selecting naturally occurring chromosomal mutations, or by insertion of transposon Tn5 to conjugative plasmids. In addition, native Rhizobium populations were screened for circumstantial evidence that genetic exchange occurs (over a long period) in the environment. The Tn5 marker enabled extensive monitoring of the Rhizobium inoculant, which showed significant variation in survival in field soils of the collaborating countries. The host plant was not required for its establishment.
Based on the Ac/Ds two element transposition system from maize an activation tagging approach is suggested for the hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides) line -Esch5-. The proposed approach is based on results obtained from our earlier work on the genetic transfer of the maize transposable element Ac and its functional analysis in hybrid and pure aspen lines. It was shown that the Ac element is active in aspen and reintegrates elsewhere in genomic regions in high frequency. However, a two element transposon tagging system where Ac and Ds are put together in crosses is not feasible in trees due to the in part long vegetative phases. To overcome this barrier, an inducible two element Ac/ATDs element system is suggested to induce activation tagged variants following two independent transformation steps. In combination with a 35S enhancer tetramer and outward facing two CaMV 35S promoter located near both ends of the ATDs element, expression of genes can be elevated which are located adjacent to the new integration site of the element. As selective marker for ATDs transposition, both knocking-out the expression of a phenotypic marker (rolC gene) and a negative selection marker gene (tms) are considered. Thus, the transposition can easily be screened in primary transgenic lines.