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s/chloroplaste/Chloroplasten/gi

Forschergruppe (FOR) 5116: Kommunikation in der Wirtspflanzen-Mikroben-Interaktion durch extrazelluläre RNA, Teilprojekt: "cross kingdom exRNA Transfer" in dem Ustilago maydis/Mais Pathosystem

Bei der Untersuchung des U. maydis/Mais-Pathosystems haben wir eine Reihe von ex-mRNAs in voller Länge identifiziert, die in EVs aus kultivierten infektiösen Hyphen angereichert wurden. Die mRNAs kodieren beispielsweise Enzyme, die an der Thiamin-Biosynthese beteiligt sind, wie Thi4, deren mRNA-Menge während der Infektion hochreguliert werden. Interessanterweise enthält Thi4 ein vorhergesagtes Chloroplasten-Zielsignal, was auf einen Transfer zu den Wirtsorganellen hindeutet, um den Pflanzenstoffwechsel während der Infektion umzuprogrammieren. Um dies zu überprüfen, haben wir ein fluoreszenzgestütztes Zellsortierverfahren zur Reinigung von Protoplasten aus infizierten Pflanzen ohne Pilzhyphen entwickelt. In Pilotversuchen wurden in den sortierten Protoplasten pilzliche Transkripte nachgewiesen. Derzeit erhöhen wir die Sequenzierungstiefe, um zuverlässige Kandidaten zu erhalten. In einem gezielteren Ansatz konnten wir nachweisen, dass Thi4 mRNA und das kodierte Protein in EVs vorhanden waren. Bei diesem Beispiel könnte es wichtig sein, mRNA- und Protein-Effektor gleichzeitig zu liefern, um eine perfekte räumlich-zeitliche Kontrolle zu erreichen. Schließlich haben wir das Syntaxin-SNARE-Protein Sso1 als generischen EV-Marker etabliert. Swollen wir in Zukunft ein zuverlässiges Proteininventar von EVs erstellen, zur Identifizierung von RBPs, die für die exRNA-Kommunikation über die Grenzen der einzelnen Organismen hinweg relevant sind. In der zweiten Förderperiode werden wir untersuchen, wie und warum mRNAs während der Infektion von U. maydis auf die Wirtspflanze Mais übertragen werden. Wir untersuchen dAuslieferung von ex-mRNAs über EVs als wichtige Transportvehikel. In Zusammenarbeit mit B2 Kehr werden wir Syntaxine als EV-Markerproteine einsetzen, um die EV-Aufreinigung zu optimieren, was zu qualitativ hochwertigen mRNA- und Proteinbeständen führt. Um Komponenten der EV-Reifungs- und Beladungsmaschinerie zu identifizieren, werden wir einen Kandidatengen-Ansatz verfolgen. Ähnlich wie bei A4 Weiberg untersuchen wir definierte Mutanten im Bereich des Membrantransports, die z.B. die Bildung von Endosomen oder multivesikulären Körpern beeinflussen. Die mögliche Beteiligung von RBPs wie Annexin werden wir zusammen mit B2 Kehr und B5 Meister untersuchen. Die potentielle Translation von Pilz-mRNAs in Pflanzen wird in Zusammenarbeit mit A2 Panstruga unter Verwendung von pflanzlichen in vitro Translationssystemen analysiert. Um die Translation während der Infektion nachzuweisen, werden wir in Zusammenarbeit mit B5 Meister und A5 Gutjahr TRAP-Seq-Experimente mit Antikörpern durchführen, die spezifisch für pflanzliche Ribosomen sind. Gendeletionsmutanten von translatierten Kandidaten-mRNAs werden Einblicke in die biologische Funktion der jeweiligen Translationsprodukte geben. Im Wesentlichen werden wir den Mechanismus des ex-mRNA-Transfers und seine funktionellen Konsequenzen aufklären und so den Weg für die Identifizierung neuer Fungizid-Zielmoleküle ebnen.

Weg des Kohlenstoffs und Regulation des Saeurestoffwechsels bei Sukkulenten (Crassulaceen-Saeurestoffwechsel)

Sukkulenten, die ueber den Crassulaceen-Saeurestoffwechsel (CAM) verfuegen, vermoegen in der Nacht CO2 aus der Atmosphaere zu binden und dieses in Form von Aepfelsaeure zu speichern. Am folgenden Tag wird die Aepfelsaeure decarboxyliert und das dabei entstehende CO2 ueber den Calvin-Zyklus der Photosynthese zugefuehrt. Diese Form des Kohlenstoffgewinns ermoeglicht einen besonders sparsamen Wasserhaushalt. Es handelt sich also um eine oekologische Anpassung an wasserarme Standorte. In dem vom hier vorliegenden Bericht abgedeckten Zeitraum wurden besonders folgende Teilaspekte des CAM erforscht: 1. Charakterisierung der PEP-Carboxylase, des Schluesselenzyms des CAM und Untersuchung seiner Regulierbarkeit in vivo und in vitro. 2. Vergleich verschiedener Sukkulententypen und verschiedener Organe bzw. Gewebe einer Pflanze hinsichtlich ihrer Faehigkeit CAM durchzufuehren oder nicht. Erkenntnisziel: Erforschung der Voraussetzungen fuer das Zustandekommen des CAM bei Pflanzen. 3. Untersuchung des Weges des Kohlenstoffs im CAM. Besonders untersucht wurde das Problem, ob in den Plastoglobuli der Chloroplasten gespeicherte Lipide im CAM umgesetzt werden.

Umweltforschung Stadt Esslingen (UFES)

Die Belastungssituation der Stadt Esslingen wird laufend untersucht ueber Flechtenkartierung und Bioindikation, z.T. ueber Transplantate. Ziel ist die Erstellung eines Belastungskatasters, das mit Grundlage fuer die Stadtplanung sein kann (Umwelt-Atlas). Methoden: Wachstumsanalysen, Fluoreszenz von Chloroplasten in vivo, Enzymaktivitaet u.a.

Das sowohl in den Chloroplasten als auch im Zellkern lokalisierte WHIRLY1-Protein der Gerste als übergeordneter Regulator der Kreuztoleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stress

Für eine hohe Ertragsstabilität müssen Kulturpflanzen schnell auf Veränderungen in der Umwelt reagieren und sich wirksam an unterschiedliche, oft gleichzeitig auf sie einwirkende Stressfaktoren anpassen. Dieses Projekts betrifft das RNA/DNA-Bindeprotein WHIRLY1, das auf Grund seiner dualen Lokalisation in den Plastiden und im Zellkern ein idealer Kandidat für die Übertragung von Stress-Signalen an den Zellkern ist. Durch Untersuchungen an Gerstenlinien mit veränderten Mengen an WHIRLY1 konnte gezeigt werden, dass WHIRLY1 die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen gegenüber Änderungen in der abiotischen Umweltsituation sowie die Resistenz gegenüber Mehltau fördert. Genexpressionsanalysen mit hvwhy1 knockout Mutanten der Gerste, die mit der CRISPR RNA/Cas9 Endonuklease-Technologie erzeugt wurden, ergaben, dass WHIRLY1 bekannte Stressgene der Gerste reguliert. Untersuchungen an Mutanten von Mais und Gerste haben gezeigt, dass WHIRLY1 auch für die Entwicklung von Chloroplasten erforderlich ist. Nach der Identifizierung der für die Stressantwort wichtigen Motive des WHIRLY1-Proteins soll versucht werden, die Funktionalität des Proteins für die Chloroplastenentwicklung von der Funktionalität in der Stressanpassung der Pflanzen zu trennen. Im Zellkern ist WHIRLY1 zusammen mit dem NPR1-Protein an der von Salizylsäure abhängigen Aktivierung von PR (pathogen response) -Genen beteiligt. NPR1, der zentrale Regulator SA-abhängiger Genexpression, liegt normalerweise als Oligomer im Cytoplasma vor. Auch WHIRLY1 liegt in den Chloroplasten als Oligomer vor. Bei stressabhängiger Produktion von Salizylsäure in Verbindung mit Redoxänderungen wird NPR1 monomerisiert und wandert dann in den Zellkern. Wenn die Stresswahrnehmung durch WHIRLY1 in den Chloroplasten ähnlich erfolgt wie die durch NPR1 im Cytoplasma, ist anzunehmen, dass eine redoxabhängige Monomerisierung des WHIRLY-Komplexes für den stressabhängigen Transfer aus den Chloroplasten in den Zellkern erforderlich ist. Um zu testen, ob das konservierte Cystein in der WHIRLY-Domäne sowie ein für die Oligomerisierung erforderliches Lysin für die durch WHIRLY1 vermittelte Stressreaktion der Gerste wichtig sind, soll die why1 KO-Mutante mit mutierten HvWHIRLY1-Sequenzen sowie der nicht mutierten Sequenz komplementiert werden. Die transgenen Pflanzen sollen im Hinblick auf ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber verschiedenen abiotischen Stressfaktoren sowie Mehltau charakterisiert werden. Aufgrund der Ergebnisse soll Blattmaterial für globale Genexpressionsanalysen mittels RNAseq ausgesucht werden. Ziel dieser Untersuchungen ist die Identifizierung von Zielgenen von WHIRLY1, die in einer Kreuztoleranz-Situation (Mehltauinfektion in Kombination mit abiotischem Stress) entweder aktiviert oder reprimiert werden. Auf der Grundlage der Ergebnisse soll in der Arbeitsgruppe von Prof. Klaus Humbeck an der MLU Halle untersucht werden, ob WHIRLY1 die Transkription ausgewählter Zielgene über epigenetische Mechanismen beeinflusst.

Optimization of a Method for the Isolation of Chloroplasts from Fresh Plant Material for the Development of a Bioassay Test for the Determination of Pesticides in Water

Bio-assays are increasingly used in supplement to classical analyses to determine the effect of contamination of waters with herbicides, some of which have been shown to be able to determine herbicides within the limits in compliance with EC-ordonance for drinking water. Preliminary work carried out at the University of Bonn has demonstrated that contamination of different water systems can be identified using inhibition of the light dependent production of oxygen by chloroplasts. Further experiments at IRMM have shown a potential to transfer membrane systems of chloroplasts into stable powder that can be used to carry out such bio-assays. Results: A method has been developed tor the isolation and breakage ot chloroplasts that allow freeze drying of the thylakoid membranes. The photosynthetic activity of the lyophilized material was maintained to 86 - 95 per cent. This powder can be stored for over five month without loss of activity.

Beitraege zur Mikroanalyse von Elementen, insbesondere Schwermetallen, zur Untersuchung von Chloroplasten und zum Verhalten der Stomata geschaedigter und ungeschaedigter Kiefer- und Fichtennadeln

1. Der Beitrag zur Histologie und Ultrastruktur umfasst die Entwicklung der Praeparationsmethoden fuer eine schonende Elektronenmikroskopie und Roentgenmikroanalyse von Nadeln der Arten Picea abies und Pinus sylvestris, die Messungen und quantitativen Auswertungen. Die Objekte sind Nadelquerschnnitte geschaedigter und bedingt gesunder Fichten und Kiefern verschiedener Altersstufen. Die Proben wurden zu verschiedenen Jahreszeiten entnommen und stammen sowohl aus Freiland - wie aus Begasungsexperimenten. 2. Der Oekophysiologiebeitrag besteht in Transpirations- und Wasserpotentialmessungen an gesunden und geschaedigten Fichten zu verschiedenen Jahres- und Tageszeiten.

Biochemische Anpassung der Pflanzen, insbesondere des Photosyntheseapparates an die Wirkung von Pestiziden auf photosynthetische Reaktionen

Der Photosyntheseapparat besitzt bei vielen Pflanzen eine grosse modifikativische Plastizitaet, welche eine kurzfristige Akklimatisation an wechselnde Umweltbedingungen gestattet. Es kommt zu einer Vielzahl von oekologischen Abwandlungen der Blaetter als photosynthetisches System. Solche Anpassungen lassen sich auch bei einzelligen Algen beobachten und in vereinfachten Systemen bearbeiten. Unsere Untersuchungen der letzten Jahre zeigen, dass es sich bei den Anpassungen an unterschiedliche Lichtbedingungen um komplexe, ausbalancierte Veraenderungen vieler struktureller und enzymatischer Komponenten handelt. Hierzu gehoeren vor allem Veraenderungen der Blatt- und Zellanatomie der Enzym- und Redoxsysteme, der Pigmentverhaeltnisse sowie die Thylakoidstruktur der Chloroplasten. Es laesst sich zeigen, dass solche Reaktionen auch durch Pestizide (Kinetik, Essigsaeure, Vanadium, Eisen) induzierbar sind. Im einzelnen wurden folgende Komponenten des Photosyntheseapparates untersucht: Pigmente, Cytochrome, P-700, Chlorophyll-Protein Komplexe, Enzyme des Calcincyclus und des Stickstoffwechsels.

Oxidativer Stress in Pflanzen: Die Bedeutung eines neu entdeckten Enzyms, der Alkylhydroperoxid Reduktase

Die zunaechst aus Saeugetieren und Pilzen beschriebene Alkylhydroperoxid Reduktase ist in photoautotrophen Organismen in Chloroplasten lokalisiert. Sie dient dort offenbar der Entgiftung von Alkylhydroperoxiden, die als Nebenprodukte der Lipidsynthese und als Folge der Photochemie entstehen und ueber groessere Distanzen hinweg oxidativen Schaden bewirken koennen. Gegenstand dieses Vorhabens ist die Analyse der biochemischen und genetischen Regulation der Alkylhydroperoxid Reduktase. Inzwischen liegen transgene Suppressionsmutanten von Arabidopsis thaliana und der Blaualge Synechocystis vor, die eine erhoehte Stress-, vor allem Lichtempfindlichkeit aufzeigen.

Herkunft und Anpassung der Eichen auf Reliktstandorten (AQUAREL), Teilvorhaben 1

Eichenwälder sind in Mitteleuropa an eine Vielzahl von Habitaten angepasst. Des Weiteren weisen die Eichen in diesem geografischen Raum eine besonders hohe genetische Vielfalt auf, die durch das Aufeinandertreffen verschiedener nacheiszeitlicher Rückwanderungswege zustande kam. Die meisten Eichenwälder in Mitteleuropa sind seit langem vom Menschen bewirtschaftet. Eine Ausnahme stellen Reliktbestände auf trockenen Standorten dar, die aufgrund ihrer Wuchsschwäche und der schweren Zugänglichkeit meist nur extensiv bewirtschaftet wurden. An den dort periodisch auftretenden Wassermangel konnten sich die Eichen über lange Zeiträume hinweg anpassen. Solche Eichenbestände eignen sich daher besonders, um vergangene Anpassungsprozesse zu untersuchen und zu verstehen. Ziele dieses Vorhabens sind: (1) Die Standortbedingungen von Eichenwäldern auf Reliktstandorten in Süddeutschland und im Elsass zu erfassen und den Reliktstatus der Bestände durch Nachweis von Reliktarten in der Flora und Fauna zu bestätigen. (2) Die refugiale Herkunft der Eiche an diesen Beständen mittels Chloroplasten-DNA-Marker sowie genetische Strukturen mittels Kern-DNA zu charakterisieren und mit vorhandenen genetischen Daten aus bewirtschafteten Wäldern zu vergleichen. (3) Mittels molekulargenetischer Marker aus Kandidatgenen zu prüfen, ob Zusammenhänge zwischen der Variation an adaptiven Genorten und standörtlichen Unterschieden auftreten, was auf Anpassung durch natürliche Selektion hindeuten würde. (4) Die Altbäume und ihre Nachkommenschaften auf ihre stressphysiologischen Fähigkeiten hin zu prüfen, um Erkenntnisse über Ihre Trockenheitsresistenz zu gewinnen. (5) Die Grundlagen für die Anlage einer Nachkommenschaftsprüfung zu schaffen, um die genetisch fixierten Wuchseigenschaften der untersuchten Bestände zu prüfen. Dies soll langfristig die Frage beantworten, ob die Verwendung von Vermehrungsgut aus solchen Vorkommen einen Beitrag zur Begründung klimastabiler Wälder leisten kann.

Herkunft und Anpassung der Eichen auf Reliktstandorten (AQUAREL), Teilvorhaben 3

Eichenwälder sind in Mitteleuropa an eine Vielzahl von Habitaten angepasst. Des Weiteren weisen die Eichen in diesem geografischen Raum eine besonders hohe genetische Vielfalt auf, die durch das Aufeinandertreffen verschiedener nacheiszeitlicher Rückwanderungswege zustande kam. Die meisten Eichenwälder in Mitteleuropa sind seit langem vom Menschen bewirtschaftet. Eine Ausnahme stellen Reliktbestände auf trockenen Standorten dar, die aufgrund ihrer Wuchsschwäche und der schweren Zugänglichkeit meist nur extensiv bewirtschaftet wurden. An den dort periodisch auftretenden Wassermangel konnten sich die Eichen über lange Zeiträume hinweg anpassen. Solche Eichenbestände eignen sich daher besonders, um vergangene Anpassungsprozesse zu untersuchen und zu verstehen. Ziele dieses Vorhabens sind: (1) Die Standortbedingungen von Eichenwäldern auf Reliktstandorten in Süddeutschland und im Elsass zu erfassen und den Reliktstatus der Bestände durch Nachweis von Reliktarten in der Flora und Fauna zu bestätigen. (2) Die refugiale Herkunft der Eiche an diesen Beständen mittels Chloroplasten-DNA-Marker sowie genetische Strukturen mittels Kern-DNA zu charakterisieren und mit vorhandenen genetischen Daten aus bewirtschafteten Wäldern zu vergleichen. (3) Mittels molekulargenetischer Marker aus Kandidatgenen zu prüfen, ob Zusammenhänge zwischen der Variation an adaptiven Genorten und standörtlichen Unterschieden auftreten, was auf Anpassung durch natürliche Selektion hindeuten würde. (4) Die Altbäume und ihre Nachkommenschaften auf ihre stressphysiologischen Fähigkeiten hin zu prüfen, um Erkenntnisse über Ihre Trockenheitsresistenz zu gewinnen. (5) Die Grundlagen für die Anlage einer Nachkommenschaftsprüfung zu schaffen, um die genetisch fixierten Wuchseigenschaften der untersuchten Bestände zu prüfen. Dies soll langfristig die Frage beantworten, ob die Verwendung von Vermehrungsgut aus solchen Vorkommen einen Beitrag zur Begründung klimastabiler Wälder leisten kann.

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