Im Projekt CYAQUATA werden die Wechselwirkungen zwischen dem Auftreten toxinbildender Cyanobakterien (CB) und der Wasserqualität in Talsperren untersucht. Hintergrund ist die seit einigen Jahren beobachtete Zunahme von CB in verschiedenen Talsperren. Verschiedene CB bilden Toxine (Cyanotoxine, CT), welche die Nutzung der betroffenen Talsperren erheblich beeinträchtigen. In Freiland- und Laborversuchen sollen die wesentlichen limnologischen und hydrochemischen Faktoren für die Massenentwicklung von CB und die Bildung von CT identifiziert und das toxikologische Gefährdungspotential der CT bewertet werden. Darauf aufbauend werden Gegenmaßnahmen abgeleitet und eine nachhaltige Bewirtschaftungsstrategie entwickelt.
In den vergangenen Jahren wurde in Talsperren eine deutliche Zunahme von Cyanobakterien (CB) registriert, die und a. aufgrund der Bildung von Cyanotoxinen (CT) deren Nutzung (wie Wasserversorgung, Erholung, Fischerei) erheblich beeinträchtigen können. Dabei profitieren die CB möglicherweise von den Auswirkungen des Klimawandels. Im geplanten Vorhaben sollen daher die genauen Ursachen für das verstärkte Auftreten von CB in verschiedenen Talsperren untersucht werden, um Schlüsselfaktoren für deren Massenentwicklung sowie einer damit verbundenen Toxinbildung bzw. -freisetzung zu identifizieren. Die Cyano Biotech GmbH konzentriert sich im Rahmen des Verbundvorhabens auf die Entwicklung und Bereitstellung von neuen sowie bereits bekannten CT in Form analytischer Standards und deren Einsatz für die Quantifizierung von CT im Rahmen des Monitorings der Talsperren und von Freiland- und Laborexperimente. Die Cyano Biotech widmet sich der Feststellung von CT-Produzenten innerhalb des Monitorings (AP1), der CT-Isolierung und -Bereitstellung in Form von Bioreagenzien und analytischen Standards sowie der Validierung neuer Methoden und Verfahren der Probennahme und -anreicherung unter Einsatz der CT-Standards (AP5). Darüber hinaus widmet sich die Cyano Biotech der Toxinanalytik bei Freilandversuchen in der TS Saidenbach (AP2) mit dem Ziel der Feststellung, welche CB und CT in den Blüten unter welchen Bedingungen dominierenden. Darüber hinaus wird sich die CBT auch der Durchführung von Laborversuchen widmen, mit dem Ziel der Feststellung wesentlicher Einflussgrößen auf Aus- und Rückbildung von CB-Arten mit hohem Toxinbildungspotential (AP3). Die in enger Kooperation mit den weiteren Partnern erzielten Resultate und gewonnenen Erkenntnisse werden innerhalb des Konsortiums ausgewertet und diskutiert und für die Ausarbeitung der Leitlinie für eine praxisorientierte Erfassung und Bewertung von CB und CT herangezogen (AP7).
Tetanusimpfstoffe werden aus dem Neurotoxin des Bakteriums Clostridium tetani durch chemische Inaktivierung hergestellt. Nach den Vorgaben des Europäischen Arzneibuchs muss das bei der Inaktivierung entstandene Toxoid durch in vivo-Toxizitätstests auf die Abwesenheit von Tetanustoxin und die Irreversibilität des Toxoids geprüft werden. Dabei werden Proben von jeder hergestellten Tetanustoxoid-Charge in 15 (für Humanimpfstoffe) bzw. 10 Meerschweinchen (für Veterinärimpfstoffe) injiziert, und die Tiere werden 3 Wochen in Bezug auf Symptome von Tetanus-Toxizität beobachtet. Das Projektziel besteht in der Entwicklung eines in vitro-Testsystems zum Nachweis bzw. Ausschluss von aktivem Tetanus-Neurotoxin (TeNT), das diese Tierversuche ersetzen kann. Da Zellkultur-basierte Modelle zur Detektion von Tetanus-Toxizität keine ausreichende Sensitivität bieten, konzentriert sich unser Projekt auf den funktionellen Nachweis von TeNT mit biochemischen Methoden. TeNT-Moleküle bestehen aus zwei Untereinheiten: Die schwere Kette vermittelt die Bindung und Aufnahme des Toxins in Nervenzellen, während die leichte Kette eine Proteasedomäne enthält, die in den Zellen spezifisch das Protein Synaptobrevin spaltet. Diese Spaltung hemmt die Freisetzung inhibitorischer Neurotransmitter und stellt den entscheidenden Schritt im Wirkmechanismus des Toxins dar. Frühere Ergebnisse unserer Projektgruppe hatten gezeigt, dass Methoden, die entweder ausschließlich auf dem Nachweis der Proteaseaktivität oder der Bindungsfähigkeit des Toxins beruhen, für eine sichere Bestimmung von Tetanus-Toxizität ungeeignet sind. Deshalb haben wir ein kombiniertes Testsystem entwickelt, das durch die funktionelle Verknüpfung von zwei Methoden beide für die Toxizität relevanten Eigenschaften von TeNT berücksichtigt. Die Besonderheit dieses Testsystems besteht darin, dass Toxinmoleküle nur dann ein Signal erzeugen, wenn sie sowohl eine funktionsfähige Bindungsdomäne als auch eine aktive Proteasedomäne besitzen - und wenn sich zudem diese Domänen auf separaten, durch Reduktion trennbaren Untereinheiten befinden. Wir konnten bereits zeigen, dass das kombinierte Testsystem zwischen giftigem TeNT und ungiftigem Tetanustoxoid unterscheiden kann. Außerdem kann aktives TeNT, das zu Impfstoff-Toxoiden künstlich zugesetzt wurde, mit diesem Testsystem detektiert werden. Das bisher entwickelte Testsystem ist demnach für den funktionellen Nachweis von Tetanustoxin geeignet. Vor allem die Sensitivität der Methode muss jedoch weiter verbessert werden. Das Ziel der derzeitigen Arbeiten besteht deshalb in der Optimierung diverser experimenteller Parameter, um die Nachweisgrenze der Methode an diejenige des Tierversuchs anzunähern. Weiterhin soll getestet werden, ob die Methode für die Prüfung von Tetanustoxoiden aller relevanten Impfstoffhersteller anwendbar ist. Längerfristig streben wir eine Aufnahme des kombinierten Testsystems in das Europäische Arzneibuch als Ersatz für die oben genannten Tierversuche an.
Harmful algal blooms (HABs) are caused by local proliferation of algae, with deleterious consequences, particularly in coastal waters throughout the world. Negative environmental effects include toxicity to human consumers of seafood, marine faunal mortalities or morbidity, habitat damage, disruption of marine food webs and economic losses to fishing, aquaculture, and tourism. In Europe, socio-economic factors and human health risk have led to comprehensive surveillance programmes for harmful microalgae and their toxins. Among harmful microalgae and cyanobacteria in European marine and brackish waters, many produce potent neurotoxins, ichthyotoxins or hepatotoxins. Although structural elucidation of many of these groups of toxins has advanced, much less is known about biosynthetic pathways and gene regulation in toxigenic species. We propose a limited genomic study of expressed sequence tags (ESTs) for toxigenic representatives of major eukaryotic microalgal groups, including dinoflagellates, raphidophytes, prymnesiophytes and diatoms, and cyanobacteria. Cultures will be grown under various environmental conditions to investigate the effects of external forcing functions on gene expression linked to toxicity and growth. After cloning of cDNA of toxigenic strains pooled from cultures grown under these different conditions into plasmid vectors, about 10,000 clones from each taxon will be randomly sequenced for ESTs. Our approach is to annotate the ESTs and attempt to identify genes associated with toxin production. DNA microarrays will be developed for screening of toxigenic and non-toxigenic strains. In addition, the sequence data will be analysed to identify other genes that may be involved in cell regulation or growth, cell cycle events, stress response and the induction of sexuality. Cultures will be grown under various environmental conditions to investigate the effects of external forcing functions on gene expression linked to toxicity and growth. Successful completion of this project will yield new information on microalgal and cyanobacterial genomic sequences for a diversity of taxa and will assist in the diagnosis of genes related to toxin biosynthesis and the formation of toxic blooms.