Der Wirkungsmechanismus von drei bakteriellen Antagonisten der Arten Pantoea agglomerans, Rahnella aquatilis und Bacillus subtilis, die bereits erfolgreich im Freiland eingesetzt wurden, soll naeher charakterisiert werden. Hierzu soll zunaechst ueberprueft werden, ob die Bakterienstaemme bakterizide Substanzen produzieren. Nachfolgend ist geplant, diese Stoffe durch chromatografische Techniken aufzureinigen und hinsichtlich ihrer Struktur zu untersuchen. Um die genetischen Grundlagen der antagonistischen Wirkung aufzuklaeren, wurden Methoden zur Tn5-Mutagenese von Pantoea agglomerans und Rahnella aquatilis sowie zum Screening von Mutanten dieser Arten entwickelt. Von Pantoea agglomerans konnten bereits 18 Mutanten mit vollstaendig fehlender antagonistischer Wirkung selektiert werden, deren naehere Charakterisierung geplant ist. Die Ueberlebensfaehigkeit der bakteriellen Antagonisten in der Phyllosphaere soll durch eine Optimierung des Substrates fuer die Anzucht und der Zusatzstoffe fuer die Formulierung verbessert werden.
Feuerbrand wird durch ein Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceen, Erwinia amylovora, verursacht. Dieser in der EU/Richtlinie 2000/129 EG Anhang II gelistete Quarantäneschadorganismus führt an vielen Obst- und Zierpflanzen aus der Familie der Rosaceen zu Absterbeerscheinungen. Eine langfristige Bekämpfung dieser Pflanzenkrankheit erfordert eine Eradikation potentieller Infektionsquellen. Ein Ziel dieses EUPHRESCO-Pilotprojektes war die Entwicklung und Validierung von Methoden, die es ermöglichen, Stämme von E. amylovora zu differenzieren, um damit mögliche Inokulum-Quellen zu identifizieren (source-tracking). Zur Erreichung dieses Ziels wurden verschiedene Ansätze verfolgt: Die Sequenzierung des Genoms von E. amylovora und die Analyse der Plasmid-Diversität bzw. die Verteilung der verschiedenen Plasmide in E. amylovora - Stämme aus unterschiedlichen geographischen Regionen. In diesem Projekt wurden 14 verschiedene E. amylovora - Stämme sequenziert und anhand der Sequenzdaten molekulare Marker identifiziert und hinsichtlich ihrer Eignung für die genetische Typisierung von Stämmen validiert. Spezielle Sequenzen (VNTRs - Variable Number of Tandem Repeat) und die Plasmid-Typisierung waren für source-tracking geeignet. Mit Hilfe des VNTR-Systems wurden High-throughput PCR-Methoden entwickelt und validiert. Eine duplex-PCR wurde zur Typisierung der Plasmide pEA29 und pE170 entwickelt und validiert. Damit stehen zwei neue methodische Ansätze für ein source-tracking von E. amylovora zur Verfügung. Spezielle Probeziehungsplänen für source-tracking konnte aufgrund des engen Zeitrahmens des Projektes nicht erstellt werden. Die Verteilung der verschiedenen Plasmide in europäischen und außereuropäischen E. amylovora - Stämmen wurden mit einer duplex PCR untersucht. Es wurden 1534 verschiedene Stämme gescreent, dabei zeigte sich, dass die Prävalenz des Plasmides pE170 zwischen 0 und 92,8Prozent lag. Ein Screening von spanischen Stämmen ergab, dass das Plasmid pEA29 am häufigsten vorhanden ist. Das gemeinsame Auftreten von pE170 und pE29 ist selten (12Prozent), Stämme ohne die beiden Plasmide kommen fast gar nicht vor (0,7Prozent). Ein weiteres Ziel dieses Projektes war die Validierung von neu entwickelten und publizierten Feuerbrand-Nachweismethoden im Labor und im Freiland. Die Validierung erfolgte in zwei Stufen: Zur Auswahl geeigneter Methoden wurden Voruntersuchungen von verschiedenen Projektpartnern durchgeführt. Danach wurden ausgewählte Methoden in einem Ringtest validiert. Voruntersuchungen umfassten die Auswahl von DNA-Extraktionsmethoden, konventionellen PCR-Assays und real time PCR-Assays. 8 verschiedene DNA-Extraktionsmethoden wurden mit 11 unterschiedlichen Pflanzenmatrices getestet. Je vier Protokolle von DNA-Extraktionsmethoden und neuen konventionellen PCR-Assays wurden für eine Validierung im Ringtest ausgewählt. usw.
Ziel des Projektes ist es, antagonistische Bakterien und Hefen gegen verschiedene mikrobielle Erreger von Pflanzenkrankheiten zu isolieren, zu charakterisieren, im Pilotmaßstab zu produzieren und sie hinsichtlich ihrer Eignung als Pflanzenschutzmittel zu testen.
Drei Bst DNA Polymerasen wurden im Einsatz bei der Blue EaLAMP getestet, wobei die neueren Bst DNA Polymerasen (Bst 2.0 und Bst 2.0 WarmStart) keinen Vorteil brachten. Diverse chemische Substanzen in den Proben für die Blue EaLAMP können diese stören, was jedoch nur jene Proben betrifft, die aus konventioneller Probensammlung (Blütenwaschwasser) stammen. Dieses Problem wird durch das Bienen-Monitoring umgangen. Die Blue EaLAMP-Reaktionsgefäße können bis zur Verwendung über einen langen Zeitraum (bisher 43 Tage getestet) bei -20 C gelagert werden. Dieser Zeitraum umspannt zumindest die Kernobstblütezeit. Im Jahr 2012 wurden an 3 Standorten in Österreich und an einem Standort in der Schweiz Untersuchungen zum Vorkommen des Feuerbranderregers Erwinia amylovora in Erwerbsobstbaugebieten durchgeführt. Während der Kernobstblüte erfolgten dabei parallel ein Bienen- und Blütenmonitoring, um qualitative und quantitative Informationen über ein mögliches Vorkommen von E. amylovora im Flugkreis der Bienen, bzw. in den beprobten Erwerbsobstanlagen, zu erhalten. Die zum Erregervorkommen gewonnenen Daten aus dem Bienen- und Blütenmonitoring wurden im Nachhinein mit jenen aus einem Feuerbrand-Prognosesystem (MaryblytTM) in Beziehung gesetzt. Pro Versuchsstandort kamen 2 - 5 Bienenvölker zum Einsatz. An diesen waren am Flugloch je 2 Röhrenkollektoren mit Folien pro Volk montiert, um die Feuerbranderreger zu erfassen. Die Betreuung der Völker, der Wechsel der Kollektorröhren und die Sammlung der Blütenproben erfolgten durch die Imker bzw. Obstbauern vor Ort einmal pro Tag. Der qualitative und quantitative Nachweis von E. amylovora erfolgte mittels qPCR. Die Praxistests mit Röhrenkollektoren verliefen ohne Probleme für die Bienenvölker. Die unterschiedlichen Beutentypen und Aufstellungsarten der Bienenvölker erforderten Anpassungen bei der Montage der Versuchseinrichtungen. Sowohl mit dem getesteten System eines bienengestützten Monitorings als auch mit der Untersuchung der parallel gezogenen Blütenproben war es möglich, E. amylovora im Sammelgebiet der Bienenvölker bzw. den beprobten Obstanlagen nachzuweisen. Zwischen Völkern, Probenahmeterminen und Folien bzw. Blütenproben zeigten sich Unterschiede im qualitativen und quantitativen Ergebnis des E. amylovora-Nachweises. Daraus leitet sich die Notwendigkeit ab, zumindest mehrere Monitoringvölker pro Standort einzusetzen bzw. eine repräsentative Anzahl von Blütenproben in der zu untersuchenden Obstanlage zu ziehen. usw.
1. Die Schweizer Obstbranche benötigt innovative Produkte mit Mehrwert, um künftig konkurrenzfähig zu bleiben. ACW-Neuzüchtungen bei Apfel, Birne und Aprikose leisten einen Beitrag zur Swissness und zur erfolgreichen Positionierung am Markt. ACW-Sorten wie Milwa (Diwa®) und La Flamboyante (Mairac®) konnten in der Schweiz und international erfolgreich im Markt eingeführt werden. Aktuell sind die Neuheiten Galiwa und die feuerbrandrobuste 'ACW 14959'. ACW arbeitet in der Obstzüchtung vernetzt, wendet neuste Techniken der molekularen Selektion an und beteiligt sich an Projekten zu deren Entwicklung wie z.B. EU-Projekt Fruitbreedomics. Das Sortenmarketing erfolgt über die VariCom GmbH (www.varicom.ch). 2. Der Kernobstanbau ist in der Schweiz von der Bakterienkrankheit Feuerbrand stark bedroht und betroffen. Der Einsatz von Antibiotika gegen diese Krankheit ist kein erwünschter und nachhalter Ansatz. Die Entwicklung von feuerbrandtoleranten und -resistenten Sorten ist eine nachhaltige Strategie, die in der ACW-Züchtung intensiv verfolgt und mit Drittmittelprojekten zusätzlich forciert wird. Erste vielversprechende feuerbrandtolerante Neuzüchtungen bei Apfel und Birne sind in der Pipeline. 3. Bei den Obstgenressourcen erfolgt die Erhaltung in der Schweiz dezentral und koordiniert durch die SKEK (Schweiz. Kommission für die Erhaltung von Kulturpflanzen). ACW ist ein gefragter Kooperationspartner bei der Charakterisierung der Obstgenressourcen (Infrastruktur für Feuerbrandtests, molekulare Sortencharakterisierung) und für die internationale Koordination. Die Ergebnisse und Netzwerke sind auch für die ACW-Züchtung wertvoll.
Die Anfälligkeit der Erwerbssorten bei Apfel und Birne gegenüber Feuerbrand ist recht gut untersucht, bei den Streuobstsorten bestehen allerdings noch erhebliche Wissenslücken. Feuerbrandtolerante Streuobstsorten könnten ein wichtiger Baustein der Resistenzzüchtung für den Erwerbsobstbau sein. Ziel dieses Interreg IV-Projektes ist es, geeignete Alternativen zum Einsatz von Antibiotika im Obstbau zu finden, ebenso eine gemeinsame Strategie für Kulturmaßnahmen gegen Feuerbrand. Gesucht wird außerdem nach feuerbrandtoleranten Sorten für die Streuobstbestände, aufbauend auf den Ergebnissen des Interreg III A - Projektes 'Erhaltung alter Kernobstsorten im Bodenseeraum', was die Hauptaufgabe der LWG im Projekt ist (siehe www.kernobst-bodensee.org). Hinzu kommt eine projektbegleitende Kommunikation und Öffentlichkeitsarbeit. Die folgenden Ausführungen konzentrieren sich auf den Projektbeitrag der LWG im PS 4 Sorten.
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Feuerbrand kann im Kernobstbau zu großen Ausfällen führen. In Deutschland sind zurzeit 13.500 ha Apfel- und Birnenanlagen von dieser Problematik betroffen. Für die Bekämpfung von Feuerbrand war bis 2004 das Antibiotikum Streptomycin zugelassen, dessen Anwendung nur noch nach Paragraph 11 Abs. 2 Satz 1 Nr. 2 PflSchG bei Gefahr im Verzüge' erlaubt ist. Allerdings ist die Anwendung von Antibiotika im Pflanzenschutz heftig umstritten, da unerwünschte Auswirkungen auf die Umwelt sowie Wirkungsverluste durch Resistenzbildung zu befürchten sind. Ziel des Projekts ist deshalb die Entwicklung einer praxisreifen Methode zur Bekämpfung von Feuerbrand, ohne den Einsatz von Antibiotika (entsprechend der Strategie der europäischen Gemeinschaft zur Bekämpfung der Resistenz gegen antimikrobielle Mittel) und unter Verwendung eines umweltneutralen Applikationssystems, welches geeignete Substanzen direkt in das Xylem von Bäumen appliziert. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden In einem ersten Arbeitsschritt wurde die Wirkung xylemapplizierter Substanzen (Bion® (Acibenzolar-S-methyl), Prohexadion-Ca und Fosetyl-AI), die nach Aufnahme in pflanzliches Gewebe über sekundäre Biosynthesewege eine Resistenzbildung gegen den Feuerbranderreger anregen können, in Gewächshaus- und Freilandexperimenten untersucht. Parallel dazu entwickelte der Kooperationspartner TU Kaiserslautern einen auf den Einsatzzweck abgestimmten und, im Gegensatz zu bisherigen Fabrikaten, gewebeschonenden Baumapplikator. In einem weiteren Schritt erfolgt die Verknüpfung dieser Arbeiten: Eine als besonders geeignet ermittelte Wirksubstanz wird zusammen mit dem neu entwickelten Baumapplikator im Freilandexperiment eingesetzt. Hierbei erfolgen Beurteilungen bezüglich der Wirkung der xylemapplizierten Substanz sowie der, aufgrund der Montage des Baumapplikators resultierenden Wunden. Ebenso werden rückstandsanalytische Untersuchungen mit den Früchten der, im Freilandexperiment eingesetzten Versuchsbäume durchgeführt. Im Anschluss an das Projekt ist die Vermarktung des neu entwickelten Verfahrens in Kooperation mit der Trifolio-M GmbH geplant. Prohexadion-Ca ist besonders xylemgängig und erzielte hervorragende Wirkungen gegen Erwinia amylovora, welche denen von Plantomycin entsprachen. Bion® (Acibenzolar-S-Methyl) erscheint ebenfalls geeignet, müsste aber formulierungstechnisch bearbeitet werden, um die notwendigen Applikationsmengen zu ermöglichen. Die Xylemapplikation von Fosetyl-AI erzielte lediglich eine mittlere Wirkung und erzeugte außerdem Schäden an Blättern und Knospen. Bezüglich der Entwicklung des Baumapplikators wurde eine gewebeschonende, Sekundärschäden vermeidende Injektoreneinheit erfolgreich getestet und ein Konzept für eine kostengünstige mobile Versorgungseinheit erstellt. Fazit: Xylemapplikation von Prohexadion-Ca wird im zweiten Versuchsteil unter Verwendung der technischen Neuentwicklung weiter verfolgt.
Feuerbrand stellt aufgrund seiner weit fortgeschrittenen Ausbreitung in Europa und den unbegrenzten Möglichkeiten der umweltverträglichen Bekämpfung ein immer größeres Risiko für den Erwerbsobstbau, die Baumschulen und den Streuobstanbau dar. Die Forschungsarbeiten dieses Projekts konzentrieren sich aufgrund noch immer fehlender wirksamer und nachhaltiger Bekämpfungsmöglichkeiten auf die Weiterentwicklung ausgewählter Pflanzenschutzmittel mit Antagonisten als bestmögliche Alternative zum Antibiotika-Einsatz. Zusätzlich werden konkrete, noch ungenügend untersuchte Fragestellungen aus der Praxis (Infektionsrisiko nach Rodung bzw. bei Wurzelschnitt) untersucht. Die Anwendung der erzielten Forschungsergebnisse lässt eine Verbesserung der praktischen Hilfestellung für Obstbauern im Umgang mit Feuerbrand, eine aktualisierte Imformationsgrundlage für die Beratung und nachhaltige, ökologische verträgliche Alternativen zum Antibiotika-Einsatz erwarten. Die einzelnen Ziele des Projekts sind: 1. Erforschung der Anpassungsfähigkeit des Feuerbranderregers an die pH-absenkende Wirkung der derzeit effizientesten Alternativprodukte zu Antibiotika zur Abschätzung ihrer langfristigen Wirksamkeit. 2. Evaluierung wichtiger, bisher noch nicht untersuchter Einflussparameter für eine effiziente Anwendung von Antagonisten und Erarbeitung von Verbesserungsmöglichkeiten. 3. Erforschung möglicher Wirkungen von Antagonisten gegen Feuerbrand auf weitere Schaderreger im Obstbau (Apfelschorf, Apfelmehltau). 4. Testung der Wirksamkeit von ausgewählten Antagonisten, die zur Verhinderung von Lagerfäule an Obst eingesetzt werden, gegen Erwinia amylovora. 5. Einschätzung des phytosanitären Risikos durch Wurzelreste, die nach einer Rodung im Boden verbleiben, und Bestimmung einer eventuellen Wartezeit für die Nachpflanzung. 6. Ermittlung eines möglichen Übertragungsrisikos für Feuerbrand bei dem in der obstbaulichen Praxis bei stark wachsenden Apfelsorten üblichen Wurzelschnitt. 7. Untersuchung der Bedingungen für eine Unterlageninfektion ausgehend von einer Triebinfektion.
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