Die Verwendung von Pikrinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) als Sprengstoff hat zu bedeutenden Umweltbelastungen geführt. Die Toxizität der Pikrinsäure (PA) und dessen mutagenes Reduktionsprodukt 2-Amino-4,6-Dinitrophenol schafft ein wirtschaftliches Interesse, die großen Mengen an PA in Altlasten und Abwasserströmen mikrobiologisch zu entfernen. Die Basis für die geplanten Arbeiten sind Bakterien der Gattungen Nocardioides und Rhodococcus, die über Reduktion des aromatischen Ringes und Bildung eines Hydrid-Meisenheimer (H-Pikrat) Komplexes PA als alleinige Stickstoffquelle verwenden. Zwei Enzyme aus Nocardioides simplex übertragen H von NADPH auf PA unter Bildung des H-Pikrat Komplexes. Teile der für den PA-Abbau vermeintlichen genetischen Information aus Rhodococcus opacus HL PM-1 wurden mit der Differential-Display-Technik gefunden. Ziel ist es, die Gene und Genfunktionen des gesamten PA-Abbauweges zu identifizieren und zu charakterisieren, sowie die biochemischen Kenntnisse zu vertiefen. Dies ist entscheidend für die Entwicklung von Systemen zur Entfernung von PA und für die Erschließung von neuartigen Degradationssystemen für TNT.
Aus den oben genannten Fragestellungen leiten sich die Ziele des Verbundvorhabens der LfL mit dem 2122495 - Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) ab, die unter Nutzung der gemeinsamen Ressourcen und Beteiligung der Ressourcen des Instituts für Landtechnik und Tierhaltung der LfL (ILT) sowie der 2134030 - Universität Bielefeld (CeBiTec) bearbeitet werden sollen. Es gilt: (i) schnelle und spezifische molekularbiologische Nachweismethoden entsprechend dem Kenntnisstand insbesondere für C. difficile an der Abteilung Qualitätssicherung und Untersuchungswesen der LfL (AQU) zu etablieren oder ggf. dort neu zu entwickeln. Entsprechend der zeitlichen Möglichkeit gilt dies auch für wichtige Toxin- und Antibiotikaresistenzgene von C. difficile, MRSA, ESBL-Enterobakterien und VRE, (ii) eine belastbare Datengrundlage zum Vorkommen von C. difficile, MRSA, ESBL-Enterobakterien und nach Möglichkeit auch VRE sowie von relevanten Antibiotikaresistenzgenen in der Prozesskette landwirtschaftlichen Biogasanlagen in Bayern mit unterschiedlichem Substrateinsatz, aber insbesondere von tierischen Reststoffen, über die gesamten Prozessketten zu schaffen, (iii) zu versuchen, einen horizontalen Gentransfer auf Mikroorganismen, die den Biogasprozess durchführen, abzuklären sowie (iv) quantitative Daten für die Reduktion lebensfähiger C. difficile Einheiten im meso- und thermophilen Biogasprozess zu erarbeiten. Das Verbundvorhaben zwischen den vier inhaltlich beitragenden Institutionen ist stark interdisziplinär ausgelegt. Die bearbeiteten Themenbereiche und Aktivitäten reichen vom Versuchs-Biogasanlagenbetrieb (ILT2a) und der Beschaffung von Proben von Praxisanlagen mit Übermittlung wichtiger Betriebs- und Prozessdaten (ILT2c) und der nasschemischen Prozessanalytik über die Entwicklung und den Einsatz mikro- und molekularbiologischer Analytik (AQU1c, LGL) bis hin zur massiven Sequenzierung von Metagenomen mit bioinformatischer Auswertung (CeBiTec). Dabei bringen die Partner ihre für die Aufgabenstellung spezialisierte Infrastruktur und ihr Know-how ein.
Die Fitness und die Wirksamkeit von 4 ausgewählten, bereits in der EU zugelassenen biologischen Pflanzenschutzmitteln (biological control agents - BCAs) werden zur Bekämpfung von Schlüsselschaderregern im biologischen Weinbau getestet. Um die Fitness zu evaluieren wird ein sog. Biopesticide Tracking durchgeführt. Dazu müssen für die ausgewählten BCAs stammspezifische qPCRs entwickelt und getestet werden. Im vorliegenden Zwischenbericht wird die Entwicklung und die Validierung einer stammspezifischen qPCR für Bacillus amyloliquefaciens QST713 (SerenadeTM) beschrieben. Dazu wurde zuerst die Spezifität von publizierten Primer verglichen. Die Spezifität der getesteten Primer war für ein stammspezif. Tracking nicht ausreichend. Zur Entwicklung neuer Primer mit verbesserter Spezifität wurden variable Regionen aus einer Reihe nahe verwandter Bacillus-Stämme amplifiziert und sequenziert. Im Bereich des yngG-Gens wurden Polymorphismen gefunden, die die Entwicklung neuer Primer ermöglichten. Die entwickelten Primer waren für Bacillus amyloliquefaciens QST713 hoch spezifisch. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde ein zweistufiges qPCR Protokoll erstellt und validiert. Als Vortest für das Biopesticide Tracking an Pflanzenmaterial wurden Potter Tower Experimente mit Rebblättern durchgeführt und erste quantitative Analysen gemacht. Flavescence doree ist eine gefährliche Quaratänephytoplasmose im Weinbau. Die rebpathogenen Phytoplasmen werden durch die Amerikanische Rebzikade Scaphoideus titanus übertragen. Die Bekämpfung dieses Vektors ist obligatorisch und stellt daher gerade im Bioweinbau eine Herausforderung dar. Daher wird nach alternativen, biologisch verträglichen Kontrollmethoden gesucht. In Laborversuchen konnte der insektenpathogene Pilz Lecanicillium lecanii (MycotalTM) das 2. Larvenstadium der Amerikanischen Rebzikade infizieren. Die kumulative Mortalität lag zwischen 60 und 72Prozent.
Schaffung eines analytischen Potentials am LGL, um schnell eine unbekannte bzw. neuartige Tierseuche infektionsdiagnostisch abzugrenzen und letztlich aufzuklären.
Corynebacterium glutamicum wird seit Jahrzehnten erfolgreich für die biotechnologische Produktion von Aminosäuren eingesetzt. Aufgrund der nachgewiesenen Eignung für die großtechnische Produktion hat sich C. glutamicum zu einem wichtigen Modellorganismus in der Weißen Biotechnologie entwickelt. Das Gesamtvorhaben des ERA-IB-Projektes zielte darauf ab, C. glutamicum in iterativen Optimierungsverfahren für die Gewinnung von Grundchemikalien und Synthesebausteinen im Sinne der Weißen Biotechnologie aus nachwachsenden Rohstoffen zu nutzen und robuste sowie kostensparende Fermentations- und 'Downstream processsing'-Verfahren zu entwickeln. Dabei standen die Produkte Succinat, Fumarat, Malat, Aspartat und Itaconat im Projektfokus. Das Ziel des Teilprojektes 1 war die Konstruktion, Analyse und iterative Optimierung von C. glutamicum-Stämmen, die mit hoher Ausbeute und hoher Produktionsrate Succinat, Fumarat und/oder Malat (bzw. deren Säuren) aus nachwachsenden Rohstoffen (Zucker) produzieren. Die zentrale Vorstufe aller drei Säuren im Zentralstoffwechsel von C. glutamicum ist Pyruvat, selbst ein attraktives Produkt als Vorstufe verschiedener Chemikalien und Polymere sowie als Bestandteil oder Zusatz in Nahrungsmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika. Aus diesem Grund sollte auch zunächst ein C. glutamicum-Stamm entwickelt und analysiert werden, der effizient Pyruvat bildet. Succinat ist eine Plattform-Chemikalie, aus der eine Reihe bisher petrochemisch hergestellter Bulk'-Chemikalien synthetisiert werden können, wie z.B. 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran, Adipinsäure, g-Butyrolacton oder lineare aliphatische Esther. Fumarat wird in der Nahrungsmittelindustrie und als Ausgangsverbindung für Polymerisierungs- und Estherifizierungsreaktionen genutzt, Malat wird in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik- und in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt und wird wie Succinat und Fumarat als vielversprechender chemische Grundbaustein für Plattformchemikalien angesehen
Grünländer sind global bedeutsame Quellen für atmosphärisches Methanol, einer der häufigsten und reaktivsten organischen Verbindungen (VOC) in der Troposphäre. In diesem Zusammenhang ist die Öko-Physiologie methanolnutzender Boden-Mikroorganismen bislang kaum untersucht worden. Vorlaufende Arbeiten des Antragstellers legen nahe, dass bislang unbekannte Mikroorganismen an der Methanoloxidation im belüfteten Boden beteiligt sind. Das beantragte Vorhaben wird aktive aerobe sowie anaerobe Methanol-Nutzer (inkl. grampositive Bakterien und Pilze) in einem Grünland untersuchen. An vier häufigen Grünland-Pflanzenarten wird mittels stabiler Isotopenbeprobung (SIP) untersucht werden, ob diese mit spezifischen Methanolnutzer-Gemeinschaften assoziiert sind. Im Verlauf einer Vegetationsperiode sollen außerdem der Methanolfluss und transkribierte Genmarker aktiver Methanolnutzer in dem zu untersuchenden Grünland erfasst werden. In einem ergänzenden Laborversuch wird das Verhältnis von boden-bürtigen zum aus oberirdischen Planzenteilen stammenden Methanol bestimmt werden, und 14C-Tracer-Experimente werden Aktivitäten im Boden und in der Phyllosphäre lokalisieren. Darüber hinaus werden anaerobe methanol-nutzende Mikroorganismen identifiziert und deren Abhängigkeit von ungewöhnlichen Spurenelementen (Seltene Erden) untersucht. In einer Zusammenarbeit mit J. Williams (MPI Mainz) und A. Held (Universität Bayreuth) werden in situ Methanolflüsse mittels Protonentransfer-Massenspektrometrie (PTR MS) bestimmt, um Flussdaten mit in situ aktiven Mikroorganismen korrelieren zu können. Ergebnisse der Arbeiten werden die Grundlage für künftige Abschätzungen zum Methanolfluss auf Ökosystemebene sein, basierend auf der Physiologie einzelner Mikroorganismen und deren Verteilung im Grünland.
Projektziel war es, eine Ersatzmethode des bislang als 'golden standard' geltenden Mäuse-Bioassays ('Mäusetest') zum Nachweis von Clostridium botulinum-Neurotoxinen (Bont) in Lebensmitteln durch ein Real Time Reverse Transkriptase - PCR - Verfahren (Real Time RT - PCR) zu entwickeln. Clostridium botulinum (C. botulinum) ist ein obligat anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium, das zur Familie der Clostridiaceae gehört. Der weit verbreitete Erreger ist in der Lage, sieben verschiedene Neurotoxintypen (Bont/A-G) zu produzieren. Botulinumtoxine gelten als stärkste natürlich vorkommende Gifte, die beim Menschen und bei Tieren den Botulismus verursachen. Bei Lebensmittelvergiftungen stehen hauptsächlich die Typen A, B und E, seltener F, im Vordergrund, während bei den Tieren überwiegend die Typen C und D klinisch Botulismus hervorrufen können. Der klassische Nahrungsmittel-Botulismus ist eine lebensbedrohliche Intoxikation des Menschen. Nach einer Inkubationszeit von wenigen Stunden bis mehreren Tagen treten schwerwiegende Krankheitssymptome auf, die den Tod nach sich ziehen können. Die Untersuchung einer verdächtigen Lebensmittelprobe bedarf gemäß der DIN-Norm 10102/§ 64 LFGB, L 06.00-26 einer Anzahl von mindestens 54 Versuchsmäusen. Deshalb wurde als Alternativmethode ein Real Time Reverse Transkriptase-PCR-Verfahren (Real Time RT -PCR) zum Nachweis von C. botulinum Typ A-, B-, E- und F-Neurotoxinproduktion in Lebensmitteln entwickelt. Ein solches molekularbasiertes Verfahren dürfte gleichzeitig als Basis für die innovative Entwicklung von weiteren Ergänzungs- und Ersatzmethoden dienen. Es ist gelungen, ein molekularbasiertes Verfahren (Real Time RT-PCR-Verfahren) zu entwickeln, mit dessen Hilfe ein eindeutiger, sowohl qualitativer als auch quantitativer Nachweis einer Genexpression aller Lebensmittel-assoziierten C. botulinum Toxintypen (Typ A, B, E und F), einschließlich deren Subtypen, möglich ist. Als Ausgangsbasis zur Etablierung der neuartigen Methode dienten 67, mittels biochemischer, serologischer und molekularbiologischer Feindifferenzierungs- und Typisierungsverfahren als C. botulinum charakterisierte Stämme (24 Typ A-, 31 Typ B-, sechs Typ E- und sechs Typ F-Stämme). Durch die Etablierung entsprechender Primer-Sondensysteme konnte über dem Nachweis der mRNA und deren Transkription in die cDNA eine Bont A-, B-, E- und F-Produktion nachgewiesen werden. Die absolute Quantifizierung basierte auf einer dekadischen Verdünnungsreihe von Bont A-, B-, E- und F-cDNA und wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Die relative Quantifizierung der Bont A, B, E und F erfolgte durch den Einsatz eines als endogene Kontrolle fungierenden 'Housekeeping'-Gens, unter Einbeziehung der vergleichenden Ct-Methode. Auf dieser Weise konnte die tatsächliche Expression und somit die reale Menge an produziertem Neurotoxin ermittelt werden. Insgesamt kann eine Methodenkaskade vorgestellt werden, die als Alternative zum Mäuse-Bioassay dienen kann.
Die Methode der immunomagnetischen Separation kann sowohl für den molekularbiologischen als auch für den kulturellen Nachweis eingesetzt werden. Es kommt dabei zu einer Aufkonzentrierung der Keime aus einer Anreicherung, indem sie über Antikörper oder elektrostatische Kräfte an magnetische Partikel gebunden werden und so spezifisch 'heraus gefischt' werden können. Im Anschluss an die Separation können die Keime auf Nährböden angezüchtet werden und/oder der DNA-Extraktion für die Untersuchung mittels PCR-Verfahren unterzogen werden. Die Anwendung dieses Verfahrens ist vor allem sinnvoll, wenn Lebensmittelproben nur eine geringe Anzahl an Keimen enthalten, die sonst nicht nachgewiesen werden könnten. Zudem werden dabei Matrixbestandteile entfernt, die beim Nachweis mittels PCR-Verfahren eine Inhibition bewirken könnten und es kann damit auf eine aufwendige Extraktionsmethode verzichtet werden. Für dieses Verfahren wurde bereits im Rahmen eines anderen Forschungsprojektes das Pathatrix-Gerät der Firma Matrix angeschafft. In diesem Projekt soll die Separation von Enterobacter sakazakii, Listerien und event. Salmonellen aus Milchprodukten etabliert werden.
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| Förderprogramm | 33 |
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