Die Verwendung von Pikrinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) als Sprengstoff hat zu bedeutenden Umweltbelastungen geführt. Die Toxizität der Pikrinsäure (PA) und dessen mutagenes Reduktionsprodukt 2-Amino-4,6-Dinitrophenol schafft ein wirtschaftliches Interesse, die großen Mengen an PA in Altlasten und Abwasserströmen mikrobiologisch zu entfernen. Die Basis für die geplanten Arbeiten sind Bakterien der Gattungen Nocardioides und Rhodococcus, die über Reduktion des aromatischen Ringes und Bildung eines Hydrid-Meisenheimer (H-Pikrat) Komplexes PA als alleinige Stickstoffquelle verwenden. Zwei Enzyme aus Nocardioides simplex übertragen H von NADPH auf PA unter Bildung des H-Pikrat Komplexes. Teile der für den PA-Abbau vermeintlichen genetischen Information aus Rhodococcus opacus HL PM-1 wurden mit der Differential-Display-Technik gefunden. Ziel ist es, die Gene und Genfunktionen des gesamten PA-Abbauweges zu identifizieren und zu charakterisieren, sowie die biochemischen Kenntnisse zu vertiefen. Dies ist entscheidend für die Entwicklung von Systemen zur Entfernung von PA und für die Erschließung von neuartigen Degradationssystemen für TNT.
Grünländer sind global bedeutsame Quellen für atmosphärisches Methanol, einer der häufigsten und reaktivsten organischen Verbindungen (VOC) in der Troposphäre. In diesem Zusammenhang ist die Öko-Physiologie methanolnutzender Boden-Mikroorganismen bislang kaum untersucht worden. Vorlaufende Arbeiten des Antragstellers legen nahe, dass bislang unbekannte Mikroorganismen an der Methanoloxidation im belüfteten Boden beteiligt sind. Das beantragte Vorhaben wird aktive aerobe sowie anaerobe Methanol-Nutzer (inkl. grampositive Bakterien und Pilze) in einem Grünland untersuchen. An vier häufigen Grünland-Pflanzenarten wird mittels stabiler Isotopenbeprobung (SIP) untersucht werden, ob diese mit spezifischen Methanolnutzer-Gemeinschaften assoziiert sind. Im Verlauf einer Vegetationsperiode sollen außerdem der Methanolfluss und transkribierte Genmarker aktiver Methanolnutzer in dem zu untersuchenden Grünland erfasst werden. In einem ergänzenden Laborversuch wird das Verhältnis von boden-bürtigen zum aus oberirdischen Planzenteilen stammenden Methanol bestimmt werden, und 14C-Tracer-Experimente werden Aktivitäten im Boden und in der Phyllosphäre lokalisieren. Darüber hinaus werden anaerobe methanol-nutzende Mikroorganismen identifiziert und deren Abhängigkeit von ungewöhnlichen Spurenelementen (Seltene Erden) untersucht. In einer Zusammenarbeit mit J. Williams (MPI Mainz) und A. Held (Universität Bayreuth) werden in situ Methanolflüsse mittels Protonentransfer-Massenspektrometrie (PTR MS) bestimmt, um Flussdaten mit in situ aktiven Mikroorganismen korrelieren zu können. Ergebnisse der Arbeiten werden die Grundlage für künftige Abschätzungen zum Methanolfluss auf Ökosystemebene sein, basierend auf der Physiologie einzelner Mikroorganismen und deren Verteilung im Grünland.
Aus den oben genannten Fragestellungen leiten sich die Ziele des Verbundvorhabens der LfL mit dem 2122495 - Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) ab, die unter Nutzung der gemeinsamen Ressourcen und Beteiligung der Ressourcen des Instituts für Landtechnik und Tierhaltung der LfL (ILT) sowie der 2134030 - Universität Bielefeld (CeBiTec) bearbeitet werden sollen. Es gilt: (i) schnelle und spezifische molekularbiologische Nachweismethoden entsprechend dem Kenntnisstand insbesondere für C. difficile an der Abteilung Qualitätssicherung und Untersuchungswesen der LfL (AQU) zu etablieren oder ggf. dort neu zu entwickeln. Entsprechend der zeitlichen Möglichkeit gilt dies auch für wichtige Toxin- und Antibiotikaresistenzgene von C. difficile, MRSA, ESBL-Enterobakterien und VRE, (ii) eine belastbare Datengrundlage zum Vorkommen von C. difficile, MRSA, ESBL-Enterobakterien und nach Möglichkeit auch VRE sowie von relevanten Antibiotikaresistenzgenen in der Prozesskette landwirtschaftlichen Biogasanlagen in Bayern mit unterschiedlichem Substrateinsatz, aber insbesondere von tierischen Reststoffen, über die gesamten Prozessketten zu schaffen, (iii) zu versuchen, einen horizontalen Gentransfer auf Mikroorganismen, die den Biogasprozess durchführen, abzuklären sowie (iv) quantitative Daten für die Reduktion lebensfähiger C. difficile Einheiten im meso- und thermophilen Biogasprozess zu erarbeiten. Das Verbundvorhaben zwischen den vier inhaltlich beitragenden Institutionen ist stark interdisziplinär ausgelegt. Die bearbeiteten Themenbereiche und Aktivitäten reichen vom Versuchs-Biogasanlagenbetrieb (ILT2a) und der Beschaffung von Proben von Praxisanlagen mit Übermittlung wichtiger Betriebs- und Prozessdaten (ILT2c) und der nasschemischen Prozessanalytik über die Entwicklung und den Einsatz mikro- und molekularbiologischer Analytik (AQU1c, LGL) bis hin zur massiven Sequenzierung von Metagenomen mit bioinformatischer Auswertung (CeBiTec). Dabei bringen die Partner ihre für die Aufgabenstellung spezialisierte Infrastruktur und ihr Know-how ein.
Die Entwicklung von Biokraftstoffen, die vorwiegend aus Kohlenwasserstoffen bestehen und deshalb völlig kompatibel sind mit der vorhandenen Infrastruktur für flüssige fossile Kraftstoffe, ist derzeit von großem Interesse. Manche Bakterien synthetisieren natürlicherweise Kohlenwasserstoffe und könnten interessante Produktionsorganismen für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen darstellen. Bisher ist allerdings wenig über deren Biosynthesemechanismen bekannt, zudem verhinderte das Fehlen von genetischen Methoden Ansätze zur Steigerung der Olefinproduktion in solchen Bakterien. In diesem Vorhaben sollen gentechnisch modifizierte Stämme von Micrococcus und ggf. anderen Bakterien für die direkte Produktion von Kohlenwasserstoffen durch einstufige Fermentation aus nachhaltig verfügbaren Kohlenstoffquellen entwickelt werden. Den Schwerpunkt der geplanten Arbeiten bildet die Entwicklung von Micrococcus-Stämmen für die Herstellung von Monoketonen und Olefinen. Unter Einsatz von in unserer Arbeitsgruppe verfügbaren genetischen Werkzeugen für Mikrokokken sollen Modifikationen einerseits an einzelnen Biosyntheseenzymen und andererseits an Stoffwechselwegen eingeführt und deren Einfluss auf die Produktbildung qualitativ und quantitativ untersucht werden. Aspekte, die im Rahmen des Projekts bearbeitet werden sollen, sind die Suche nach neuen Genen für Kohlenwasserstoffbiosyntheseenzyme, die Untersuchung der Regulation der Kohlenwasserstoffbiosynthese in Micrococcus, die Erweiterung des Substratverwertungsspektrums und die Entwicklung einer Methode zur Abtrennung der gebildeten Kohlenwasserstoffe aus Produktionskulturen.
Zielsetzung ist zunächst die Identifikation der Formalkinetiken der Synthesegasverwertung von Clostridium aceticum und Clostridium carboxidivorans im kontrollierten Rührkesselreaktor, wobei insbesondere rekombinante Stämme zur Herstellung von Isobutanol, 1,4-Butandiol, 1-Hexanol und 1,6-Hexandiol untersucht werden sollen. Zur Untersuchung der Syngasverwertung im Litermaßstab soll ein neuartiges Hochdruckbioreaktorsystem entwickelt werden, das wahlweise als Rührkessel-, Blasensäulen-, Umlauf-, Membran-, Festbett- oder Tropfkörperreaktorsystem eingesetzt werden kann. Zielsetzungen sind zum einen die Identifikation besonders geeigneter Reaktorkonfigurationen für kontinuierliche Gasfermentationen (Raum-Zeit Ausbeute, Prozessstabilität) und zum anderen die modellgestützte Auswahl von geeigneten Betriebspunkten zur Erzielung hoher Produktkonzentrationen und/oder hoher Gasausbeuten. Das Vorhaben ist in drei Teilprojekte unterteilt: (i) Reaktionstechnische Untersuchungen zur Synthesegasverwertung von Clostridium aceticum im kontrollierten Rührkesselreaktorsystem. (ii) Reaktionstechnische Untersuchungen zur Synthesegasverwertung von Clostridium carboxidivorans im kontrollierten Rührkesselreaktorsystem. (iii) Vergleichende verfahrens- und reaktionstechnische Analysen von verschiedenen Bioreaktorkonzepten zur Synthesegas-Fermentation im kontrollierten Mehrzweckdruckreaktor zur Herstellung von Isobutanol, 1,4-Butandiol, 1-Hexanol und/oder 1,6-Hexandiol.
Vibrio fischeri is a luminescent marine bacterium whose luminous intensity depends on the toxicity of its surroundings. By comparing light intensity before and after a certain contact time with a water sample, these bacteria can be used to detect various environmental toxins including unknown ones. A sample is considered nontoxic when the inhibition is less then 20 percent after 30min contact. In Germany, the luminescent bacteria inhibition test described in DIN EN ISO 11348 (Part 1) is a compulsory test for waste waters of industrial origin. Commercial Luminometers use Photomultiplier tubes for detection. PMTs are highly sensitive measurement devices hence the price of commercial instruments can be up to 15,000€ (including VAT). Our group has some experience with detection of low (fluorescent) light intensities by CCD cameras and webcams. In a preceding student research project we were able to prove that selected webcams are sensitive enough to detect luminescence by Vibrio fischeri in the low concentrations used in commercially available test kits. We now have developed a simple but sensitive Luminometer based on a low priced modified (black and white CCD chip and long exposure) webcam. The inhibition of various bacteria concentrations was compared to a commercial device as well as tests with actual samples. The webcam takes a picture of the light emitting test sample. The software then calculates the average luminescence of a pre defined region of interest. An additional feature is a LED for measurement of optical density which is needed to produce bacteria suspensions with standard concentrations.
Die Fitness und die Wirksamkeit von 4 ausgewählten, bereits in der EU zugelassenen biologischen Pflanzenschutzmitteln (biological control agents - BCAs) werden zur Bekämpfung von Schlüsselschaderregern im biologischen Weinbau getestet. Um die Fitness zu evaluieren wird ein sog. Biopesticide Tracking durchgeführt. Dazu müssen für die ausgewählten BCAs stammspezifische qPCRs entwickelt und getestet werden. Im vorliegenden Zwischenbericht wird die Entwicklung und die Validierung einer stammspezifischen qPCR für Bacillus amyloliquefaciens QST713 (SerenadeTM) beschrieben. Dazu wurde zuerst die Spezifität von publizierten Primer verglichen. Die Spezifität der getesteten Primer war für ein stammspezif. Tracking nicht ausreichend. Zur Entwicklung neuer Primer mit verbesserter Spezifität wurden variable Regionen aus einer Reihe nahe verwandter Bacillus-Stämme amplifiziert und sequenziert. Im Bereich des yngG-Gens wurden Polymorphismen gefunden, die die Entwicklung neuer Primer ermöglichten. Die entwickelten Primer waren für Bacillus amyloliquefaciens QST713 hoch spezifisch. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde ein zweistufiges qPCR Protokoll erstellt und validiert. Als Vortest für das Biopesticide Tracking an Pflanzenmaterial wurden Potter Tower Experimente mit Rebblättern durchgeführt und erste quantitative Analysen gemacht. Flavescence doree ist eine gefährliche Quaratänephytoplasmose im Weinbau. Die rebpathogenen Phytoplasmen werden durch die Amerikanische Rebzikade Scaphoideus titanus übertragen. Die Bekämpfung dieses Vektors ist obligatorisch und stellt daher gerade im Bioweinbau eine Herausforderung dar. Daher wird nach alternativen, biologisch verträglichen Kontrollmethoden gesucht. In Laborversuchen konnte der insektenpathogene Pilz Lecanicillium lecanii (MycotalTM) das 2. Larvenstadium der Amerikanischen Rebzikade infizieren. Die kumulative Mortalität lag zwischen 60 und 72Prozent.
Clostridien-basierte Fermentationsprozesse wurden schon früh für die industrielle Herstellung von Butanol und Aceton intensiv genutzt. Basierend auf diesen Fermentationsprozessen sollen im Projekt mittels Metablic Pathway Engineering effiziente anaerobe Produktionsstämme zur Herstellung von energetisch leicht gewinnbaren Alkoholen (im Speziellen von Hexanol) erstellt werden. Als Rohstoffbasis soll durch gezielte metabolische Veränderungen Cellulose und Lignocellulose als Rohstoff für die Herstellung von Biokraftstoffen erschlossen werden. Das Projekt stellt somit einen wesentlichen Beitrag zur Entschärfung der sich abzeichnenden Konkurrenzsituation zwischen Biokraftstoffgewinnung und Nahrungsmittelproduktion dar Unter den heute bekannten Clostridien-Arten finden sich sowohl Organismen mit der Fähigkeit der Hexanolfermentation wie auch des effizienten Abbaus von Cellulose. Im Vorhaben ist vorgesehen, die Hexanolbiosynthese in C. kluyveri genauer zu untersuchen+die hierfür verantwortlichen Gene zu isolieren. Mittels Metabolic Pathway Engineering sollen dann die isolierten Gene in C. acetobutylicum und/oder C. cellulyticum funktionell zur Hexanolfermentation exprimiert werden. Parallel zu den Arbeiten an der Hexanol-Biosynthese soll im Projekt der effiziente Abbau von Cellulose durch die Organismen verbessert werden. C cellulyticum ist heute als guter Cellulose abbauender Mikroorganismus schon bekannt, C. acetobutylicum besitzt hierfür die genetische Veranlagung (Cellusome Operon)
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