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Bewertung der Auswirkungen von neu auftretenden schädlichen Algenblüten Arten in der Ostsee, Schädliche Effekte Fisch und Mensch

What is the role of fish intestine as environment-organism barrier? Mechanistic investigations using fish intestinal cells on a chip

Cellular epithelial barriers have important functions in the organisation of life. They are gate keepers that regulate the interaction of an organism with its surrounding environment. The intestinal epithelia is an example of an environment-organism barrier that regulates uptake from food; it transports nutrients from the intestinal lumen into the blood; at the same time it provides protection from environmental toxicants and pathogens. Another important function is osmoregulation. Fish travelling from fresh- to sea-water, for example, would literally dehydrate if the intestinal epithelium would not regulate ion and water uptake. Thus, mechanistic knowledge of the functions of epithelial barriers, such as the fish intestinal epithelium, is fundamental to our understanding of animal physiology, ecology and toxicology. This project aims to shed light on the role and functioning of the fish intestine as an environment-organism barrier. Little basic knowledge on fish intestinal epithelial function exists thus far because access to this tissue is difficult and the development of suitable models has been limited to short-lived ex vivo gut sac preparations. Therefore, we will address our aim by (1) engineering a piscine intestinal microenvironment based on newly available in vitro cell cultures and (2) visualizing and quantifying the physiologic and toxicologic response of this microenvironment to selected stimuli either non-invasive, on-line, or based on endpoint measurements, to observe intestinal barrier function. On-chip microfluidic design will be used because it enables to mimic the interaction of a model digestive fluid at the fluid-epithelia cell interphase, as well as communication between different intestinal cell types, by providing defined laminar flow and allowing for realistic, biologically relevant exposure and transport phenomena. The specific questions that we will address are: 1. How can the microchip be best designed to reconstitute the environment-intestinal barrier and allow sensible evaluation of cell function? 2. What is the longevity and differentiation state of the intestinal barrier cells if grown on the cell-chip and continuously fed a liquid mimicking the intestinal microenvironment? 3. How does the intestinal microenvironment respond to external stimuli, specifically: (a) What are the physiological changes induced by seawater adaptation? (b) Are intestinal cells capable to detoxify a model environmental contaminant by biotransformation and/or active transport? The focus will be on the teleost fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), which is well recognized as model species for freshwater fish in the Northern Hemisphere. Indeed, rainbow trout is of interest and widespread use in science (fish physiology, pathology and ecology), regulation of chemicals (ecotoxicology) and commerce (aquaculture, sports fishing). (...)

Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II, Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II

Mit 200-250 Abwasserproben vorwiegend aus dem chemisch-industriellen Bereich und ca. 50 abwasserrelevanten Monosubstanzen werden mit der Fischzellinie D11 oder RTG-2 Daten zur Toxizitaet erarbeitet (IC50-, IC30-, IC20-Werte). Neben diesen Toxizitaetswerten werden Proliferationskurven erstellt. Das Testprotokoll ist standardisiert aufgrund der Ergebnisse aus dem Vorlaufprojekt 01.07.92-30.06.94. Die Werte aus den Experimenten mit den Abwasserproben und mit den Monosubstanzen, mit denen auch Aufstockungsexperimente mit den Abwasserproben durchgefuehrt werden, dienen der Validierung des in vitro-Verfahrens als Alternative zum Fischtest. Die Arbeiten werden koordiniert mit anderen Arbeitsgruppen durchgefuehrt, die die gleichen Testprotokollbedingungen bei den gleichen Abwasserproben einsetzen. Die biometrische Bearbeitung der Daten ist zwingend vorgesehen.

Vorhaben: Probennahme und Probencharakterisierung^ISIS (Identifizierung sedimentgebundener Schadstoffe)^Vorhaben: Nachweis toxischer Wirkungen von Sedimentextrakten mit Fisch-spezifischen Testsystemen, Vorhaben: Identifizierung von Schadstoffen; Strukturaufklaerung und Synthese toxischer Substanzen; Toxititaetsgeleitete Analyse; Genotoxizitaet und hormonelle Aktivitaet

Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II, Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II

Mit 144 Abwasserproben vorwiegend aus dem chemisch-industriellen Bereich und ca. 24 abwasserrelevanten Monosubstanzen werden mit der Fischzellinie RTG-2 Daten zur Toxizitaet erarbeitet (IC50-, IC30-, IC20-Werte). Neben diesen Toxizitaetswerten werden Proliferationskurven erstellt. Das Testprotokoll ist standardisiert aufgrund der Ergebnisse aus dem Vorlaufprojekt (01.07.92-30.06.94), das von der TH Darmstadt (LMP), TU Berlin (Oekotoxikologie) und der Akademie fuer Tierschutz durchgefuehrt wurde. Die Werte aus den Experimenten mit den Abwasserproben und mit den Monosubstanzen dienen der Validierung des in vitro-Verfahrens als Alternative zum Fischtest. Die Arbeiten werden koordiniert mit anderen Arbeitsgruppen durchgefuehrt, die die gleichen Testprotokollbedingungen bei den gleichen Abwasserproben einsetzen. Die biometrische Bearbeitung der Daten ist zwingend vorgesehen.

Teilvorhaben 11: UMU-Gentoxizitaetstest^Teilvorhaben 9: Weiterentwicklung und Anwendung des Ames-Tests als Referenzverfahren^Teilvorhaben 2: Alkalische Filterelution zum Nachweis von DNA-Schaeden^Teilvorhaben 8: Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) mit Fischen und induzierten Fischzellen^Teilvorhaben 15: Koordination des Verbundvorhabens, Probennahme und biometrische Auswertung^Teilvorhaben 10: Weiterentwicklung chemisch-analytischer Verfahren zur Erfassung gentoxischer Substanzen in Waessern^Teilvorhaben 7: Comet-Assay an Primaerzellen und permanenten Zellinien von Fischen^Erprobung, Vergleich, Weiterentwicklung und Beurteilung von Gentoxizitaetstests fuer Oberflaechengewaesser^Teilvorhaben 5: Nachweis von DNA-Schaeden in aquatischen Protozoen, Pflanzen und Insekten mit der Mikrogelelektrophorese^Teilvorhaben 1: Alkalische Filterelution zum Nachweis von DNA-Schaeden mit aquatischen Organismen unterschiedlicher Organisationsstufen^Teilvorhaben 13: UDS-Test und Comet-Assay an Fisch- und Saeugetierzellinien^Teilvorhaben 14: Luminometrischer Kurzzeittest zur Untersuchung DNA-schaedigender Substanzen^Teilvorhaben 12: DNA-Reparatur als Parameter zur Bewertung gentoxischer Potentiale in Oberflaechengewaessern in Kombination mit mik^Teilvorhaben 3: In-Situ-Untersuchungen zum gentoxischen Potential ausgewaehlter Oberflaechengewaesser mit dem DNA-Aufwindungstest^Teilvorhaben 6: Comet-Assay mit Muscheln, Teilvorhaben 4: In-situ-Untersuchungen zum gentoxischen Potential ausgewählter Oberflächengewässer mit dem DNA-Aufwindungstest an Fischzellen, Fischlarven, Fischen, Krebsen und Muscheln

Es sollen Untersuchungen zur gentoxischen Belastung von gewaesserexponierten Organismen durchgefuehrt werden; hierbei soll als Summen- und Wirkparameter die Alkali-Empfindlichkeit, von DNA als Nachweis struktureller Primaerschaeden untersucht werden. Die Untersuchungen zur DNA-Denaturierung sollen mit Fischzellinien, Fischen, Muscheln und Krebsen durchgefuehrt werden. Der Schwerpunkt der Untersuchungen werden jedoch 'in situ'-Experimente (Expositon im Gewaesser) mit der Muschel Dreissena polym. sein. Der DNA-Aufwindungstest (Denaturierungsassy) kommt wegen seiner Einfachheit insbesondere fuer Routineuntersuchungen am Gewaesser in betracht. Setzt man die DNA kontrollierten alkalischen Bedingungen aus, dann denaturiert die geschaedigte DNA schneller als die ungeschaedigte DNA. Zusaetzlich soll in dem Vorhaben zur weiteren Vereinfachung versucht werden, das direkte fluorometrische Verfahren an die Durchfuehrung auf der Mikrotiterplatte zu adaptieren.

Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Teilprojekt 2: Entwicklung eines Mikrokerntests mit Fischzellen

Zur Bestimmung der gentoxischen Belastung von Industrieabwaessern, die in oeffentliche Gewaesser eingeleitet werden, wurde ein Mikrokerntest mit der Fischzellinie RTG 2 standardisiert. Versuche mit Referenzchemikalien zeigen eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit dem Testprotokoll. Versuche mit der durchflusszytometrischen Messung der induzierten Mikrokerne verliefen erfolgreich. Die Pruefung von ersten Abwasserproben ergab in einigen Faellen deutlich positive Resultate.

Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Teilprojekt 2: Entwicklung eines Mikrokerntests mit Fischzellen^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412, Teil 31: Phasen I und II, Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II

Mit 200-250 Abwasserproben vorwiegend aus dem chemisch-industriellen Bereich und ca. 50 abwasserrelevanten Monosubstanzen werden mit der Fischzellinie D11 oder RTG-2 Daten zur Toxizitaet erarbeitet (LC50-, IC30-, IC20-Werte). Neben diesen Toxizitaetswerten werden Proliferationskurven erstellt. Das Testprotokoll ist standardisiert aufgrund der Ergebnisse aus dem Vorlaufprojekt (01.07.92-30.06.94). Die Werte aus den Experimenten mit den Abwasserproben und mit den Monosubstanzen, mit denen auch Aufstockungsexperimente mit den Abwasserproben durchgefuehrt werden, dienen der Validierung des in vitro-Verfahrens als Alternative zum Fischtest. Die Arbeiten werden koordiniert mit anderen Arbeitsgruppen durchgefuehrt, die die gleichen Testprotokollbedingungen bei den gleichen Abwasserproben einsetzen. Die biometrische Bearbeitung der Daten ist zwingend vorgesehen.

Erweiterung, Optimierung und Standardisierung eines neuartigen Kurzzeittests mit Zellkulturen aus Fischen und Mollusken als Routineverfahren zur Abschaetzung des Gefaehrdungspotentials von Umweltschadstoffen im Wasser

In einem zweijaehrigen Forschungsvorhaben soll ein Kurzzeit-Biotestverfahren zur Erfassung toxischer Wirkungen von Umweltschadstoffen (Chemikalien, Abwaessern, Sickerwaesser, Sedimentextrakten) mit Zellkulturen erweitert, optimiert und standardisiert werden. Das Prinzip dieses Tests wurde mit Unterstuetzung des MWK und einer PAOE-Pilotstudie entwickelt. Am Ende des Forschungsvorhabens soll ein praxisreifes Konzept zur raschen und kostenguenstigen routinemaessigen Erfassung der toxischen Wirkung von Umweltschadstoffen im Wasser mit Hilfe alternativer Testsysteme vorgelegt werden. Angestrebt wird ein dreistufiges Screeningprogramm zur raschen Abschaetzung des Gefahrenpotentials unterschiedlichster Substanzen und Stoffgemische. Mit dem Ziel, eine moeglichst empfindliche Zellinie fuer den Test vorschlagen zu koennen, werden neben Primaerzellkulturen aus der Leber der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und der Dauerzellinie R1 (s Pilotprojekt) die etablierten amerikanischen Fischzellinien RTG-2, BF-2 und FHM sowie als Wirbellosenzelle die Linie Bge aus Mollusken in das Testprogramm integriert. In der Grundstufe des geplanten Programms wird mit den fuenf Dauerzellinien und isolierten Leberzellen aus der Regenbogenforelle ueber 24 bis 48 Stunden mit konventionellen Methoden (Faerbeverhalten, Enzymfreisetzung, Anheftung, Morphologie) die akut cytoxische Wirkung des Wirkstoffes bzw Schadstoffgemisches in Screeningtests erfasst. In der zweiten Pruefstufe werden aufwendigere Untersuchungen wie Enzymmessungen oder cytologische Studien an den Zellen nach kurzzeitiger Belastung mit Stoffen in umweltrelevanten Konzentrationen durchgefuehrt, wobei vor allem die Aktivitaet spezifischer Entgiftungsenzyme ermittelt werden soll. In der dritten Untersuchungsstufe werden Daten zu cytologischen und biochemischen Veraenderungen in isolierten Leberzellen nach verlaengerter subletaler Belastung erhoben. In diesem Forschungsvorhaben sollte ein Kurzzeit-Biotestverfahren mit Zellkulturen zur Erfassung toxischer Wirkungen von Umweltschadstoffen im Wasser erweitert, optimiert und standardisiert werden mit dem Ziel, ein rasches und kostenguenstiges Routineverfahren als Alternative zum integralen Fischtest bereitzustellen. In das Testprogramm aufgenommen wurden Primaerzellkulturen aus der Leber der Regenbogenforelle (Hepatocyten), die fibrocytischen Fischzellinien R1 und RTG-2 sowie die Zellinien BF-2 aus dem Amerkanischen Sonnenbarsch. Mit isolierten Hepatocyten, die bis zu 14 Tagen in Kultur gehalten werden koennen, wurden die Referenzsubstanzen 4-Chloranilin, 2,4-Dichlorphenol, Dinitro-o-kresol und 4-Nitrophenol, die Pestizide Atrazin und Disulfoton, das Fischtherapeutikum Malachitgruen sowie Deponiesickerwaesser auf toxische Wirkung untersucht. Als Endpunkt wurden ultrastrukturelle und enzymbiochemische Parameter verwendet, die sich als empfindliches Nachweissystem fuer akute, subakute und subletale Schadstoffwirkungen eignen...

Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II^Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II, Validierung eines Zytotoxizitaetstests als Ersatzmethode zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 - Phase II

Anhand eines standardisierten Testprotokolls wird mit den Fischzellinien D11 und RTG-2 die Zytotoxizitaet (IC50-, IC30-, IC20-Werte) von 200-250 Abwasserproben, von etwa 50 abwasserrelevanten Monosubstanzen und von aufgestockten Abwasserproben bestimmt. Zusaetzlich zu den Toxizitaetsmessungen werden (a) Proliferationskurven fuer die Zellinien erstellt; (b) Methoden zu Zytotoxizitaetspruefung mit Fischzellinien in serumreduzierten oder serumfreien Medien entwickelt; (c) Studien zur Biotransformationskapazitaet der Zellinien durchgefuehrt. Die Untersuchungen erfolgen koordiniert mit anderen Arbeitsgruppen und werden von einer biometrischen Datenanalyse begleitet. Ziel der vergleichenden Zytotoxizitaetsmessung einer grossen Anzahl identischer Proben in verschiedenen Labors ist es, das im vorangegangenen Forschungsvorhaben entwickelte standardisierte Testprotokoll als in vitro-Alternative zum Fischtest nach DIN 38412 Teil 31 zu validieren.

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